Digitale PCR

Anwendungen der Nanoplatten-dPCR

Wichtigste Applikationen der digitalen Nanoplatten-PCR

Dank ihrer hohen Sensitivität, überragenden Präzision und absoluten Quantifizierung ist die digitale PCR in der Lage, bei einer Vielzahl von Proben und Applikationen in geringen Mengen vorliegende Targets, Targets in komplexen Mischungen und Allelvarianten nachzuweisen und geringfügige Unterschiede bei Target-Konzentrationen zu überwachen. Dazu zählen (nicht exklusiv):

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Testen von Abwasser auf COVID-19

Wastewater
Aufgrund der heterogenen Zusammensetzung von Abwasser wird eine Methode benötigt, die in der Lage ist, sehr geringe Mengen an viraler RNA in einem Gemisch mit vielen Nukleinsäure-Molekülen, die nicht das Target darstellen, zu identifizieren. Die digitale PCR kann niedrige Konzentrationen von SARS-CoV-2-RNA in Abwasser mit hoher Präzision messen und zeigt eine gute Korrelation mit qPCR-Ergebnissen. Darüber hinaus ist die digitale PCR in der Lage, genau zwischen aus Mutationen des Virus resultierenden Varianten zu differenzieren und diese zu quantifizieren, und sie bietet ein genaues Maß der Kopienzahl sowohl für Wildtyp- als auch Variantengenome.
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Wie dPCR Zielsequenzen in problematischen Proben nachweisen kann

Von Umweltproben bis hin zu Flüssigbiopsien kann die qPCR helfen, geringe Mengen an genetischen Zielen zu quantifizieren. Für komplexe Proben mit einer geringen Konzentration von Zielmolekülen könnte die dPCR jedoch die bessere Option sein, insbesondere mit neuen Systemen auf Nanoplattenbasis.
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Nachweis seltener Mutationen

Die digitale PCR ermöglicht eine gesteigerte Sensitivität beim Nachweis und der absoluten Quantifizierung seltener Ereignisse/Sequenzvarianten, da die Target-Quantifizierung unabhängig von der Zahl der Amplifikationszyklen ist. Hinzu kommt, dass die Partitionierung beim Nachweis in geringer Menge vorliegender Targets (Allelvarianten, SNPs) vor einem ausgeprägten Wildtyp-Hintergrund das Signal-zu-Rauschen-Verhältnis steigert und die Rate falsch Positiver senkt.

Zu den aufkommenden Verwendungszwecken der digitalen PCR für den Nachweis seltener Mutationen zählen:

  • Identifizierung restlicher Krebszellen unterhalb der aktuellen Nachweisgrenzen
  • Nachweis neuer Mutationen und Duplikationen bei Krebs
  • Überwachung seltener medikamentenresistenter Mutationen
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Rare mutation

Kopienzahlvariation

Copy variation

Die digitale PCR kann problemlos auch feine Unterschiede feststellen, so etwa eine weniger als 1,2-fache Veränderung der Kopienzahlvariation von vier auf fünf Kopien – und das ohne Standardkurve. Die Präzision und Sensitivität der Technologie erlauben dem System die Erkennung kleinster Veränderungen der Kopienzahl, und die Genauigkeit ist weniger anfällig für Veränderungen der Amplifikationseffizienz und das Vorliegen von Inhibitoren. In Zukunft kann und wird die Untersuchung von Kopienzahlvariationen mittels digitaler PCR in der in der Krebsforschung (Screening auf und Überwachung von Krebs-Biomarkern), in der Erforschung neurologischer Erkrankungen und bei Populationsstudien eingesetzt werden.

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Genexpressionsanalyse

Die gesteigerte Präzision der digitalen PCR kann in vielen Bereichen der Genexpressionsanalyse für eine höhere Auflösung sorgen. Sie ermöglicht die Überwachung kleinster Veränderungen des Expressionsniveaus – selbst geringer als zweifach. Die digitale PCR bietet auch eine höhere Sensitivität bei der Quantifizierung von seltenen Targets oder von RNA bei sehr geringen Mengen an Ausgangsmaterial.

Zu den aufkommenden Verwendungszwecken der digitalen PCR für Genexpressionsanalysen zählen:

  • Untersuchung von Methylierungsereignissen
  • Quantifizierung von Transkriptionsniveaus
  • Messung von Veränderungen der miRNA-Konzentration
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gene expression analysis

Zell- und Gentherapie

group of dividing cells

Die digitale PCR ermöglicht eine Reihe an Applikationen in der Zell- und Gentherapie wie die Messung von Virustiter und Vektorkopienzahl oder die Entwicklung und Herstellung von Gen- und CAR-T-Zelltherapien. Sie hilft auch bei der zuverlässigen Validierung der Qualität Ihres Therapeutikums. Dies ist von zentraler Bedeutung bei der Entwicklung wirksamer und reproduzierbarer Gentherapien bei gleichzeitiger Gewährleistung der Patientensicherheit.

Entdecken Sie, wie QIAcuity dPCR eine ebenso hohe Genauigkeit und Präzision bei der Quantifizierung von Virustitern erzielen kann wie das derzeitige Goldstandard ddPCR-System, jedoch mit einer höheren Geschwindigkeit und einem insgesamt höheren Durchsatz sowie besserer Skalierbarkeit.

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Nachweis mikrobieller Pathogene

Mikrobielle Krankheitserreger sind allgegenwärtig und berühren alle Aspekte unseres Lebens, von der Gesundheitsvorsorge bis zur Lebensmittelproduktion. Ihr Vorkommen in geringen Mengen in metagenomischen Proben, isolierten Kolonien oder anderen problematischen Probenarten erschwert jedoch den spezifischen Nachweis und die Überwachung dieser Keime. Hier kommt die digitale PCR mit ihrer hohen Präzision und Sensitivität bei der Identifizierung eines breiten Spektrums mikrobieller Zielgene zum Einsatz, einschließlich Genen von Bakterien, Pilzen, Parasiten, Viren, Antibiotikaresistenz und Virulenzfaktoren in unterschiedlichen Proben.

Mit dem neuen Assay-Portfolio zum Nachweis von mikrobieller DNA mittels dPCR:

  • Identifizierung von >680 Zielen
  • Kombinierter Nachweis von mikrobieller DNA und viraler RNA in einer Reaktion
  • Nachweis von bis zu fünf Zielen je Reaktion
  • Einfacher und schneller dPCR-Arbeitsablauf in etwa zwei Stunden
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3D illustration of a e. Coli bacteria, microbiome, gut bacteria, gastro, microorganism
Erregernachweis durch digitale PCR
Erfahren Sie mehr über die neuen dPCR-Assays, mit denen sich Mikrobenspezies, Antibiotikaresistenz- und Virulenzgene aus unterschiedlichsten Proben schnell nachweisen lassen.
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Erfahrungsberichte
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was unsere Kunden sagen

„Bei der Arbeit mit einem Gen, das wirklich sehr variabel ist und eine hohe Kopienzahl aufweist, reicht die Auflösung der quantitativen PCR einfach nicht aus“, sagte Dr. Johanna Andersson-Assarsson, Forscherin und Koordinatorin für die Swedish Obese Subjects(SOS)-Studie, Department of Molecular and Clinical Medicine, Universität Göteborg. Dr. Andersson-Assarsson gibt an, dass die digitale PCR aufgrund ihrer Auflösung eine Art Revolution auf dem Gebiet der Kopienzahlanalyse dargestellt hat. „Es gibt verschiedene Lösungen für die digitale PCR, die gute Ergebnisse liefern. Was mir am QIAcuity-System gefällt, sind der einfache und schnelle Workflow und die Tatsache, dass weniger Kunststoffspitzen und -platten verwendet werden, was gut für die Umwelt ist.“

„Wir verwenden Umwelt-DNA (environmental DNA, eDNA) zur Untersuchung der Artenverteilung in marinen Küstenökosystemen. Die digitale PCR hat höhere Nachweisraten bei geringen DNA-Konzentrationen und kann mit der höheren Konzentration an PCR-Inhibitoren, wie sie in solchen Ökosystemen vorliegt, umgehen. Wir haben kürzlich eine QIAGEN dPCR Plattform bestellt – den QIAcuity, weil wir ihn als besonders unkompliziert und schnell betrachtet haben. Er kann eDNA aus invasiven Arten mit höherer Genauigkeit und Sensitivität nachweisen, unabhängig von der Amplifikationseffizienz“, sagte Per Sundberg, CEO, SeAnalytics AB, Göteborg, Schweden.
„In einem Versuchslauf mit dem neuen QIAcuity Eight für hohen Durchsatz konnten wie in Abwasserproben erfolgreich neuen Varianten von SARS-CoV-2 nachweisen“, gab Dr. Franz Durandet an, Präsident bei I.A.G.E. in Montpellier, Frankreich. „Unsere Tests haben bewiesen, dass diese schnelle und skalierbare Technologie von QIAGEN eine wertvolle Ergänzung unserer umweltbiologischen Testdienstleistungen darstellen kann, die wir unseren Kunden in der nahen Zukunft anbieten werden.“
dPCR, Nicole Masters, John Spear, QIAcuity, customer testimonial, Colorado School of Mines
“Bei der Arbeit mit mikrobieller Biomasse in niedrigen Konzentrationen stellt die qPCR ein hilfreiches Tool zur Quantifizierung dar, aber die dPCR ist die beste Herangehensweise. Das QIAcuity dPCR-Gerät erlaubt uns den konsistenten Nachweis und die Quantifizierung von Mikroorganismen in Erdboden, Gestein und Wasser”, sagt Prof. John R. Spear, Department of Civil and Environmental Engineering, Colorado School of Mines, Colorado, USA.
Im Bild zu sehen: Nicole Masters, Studentin im Aufbaustudium
“Unser Labor nutzt das QIAcuity System für die digitale PCR gern zur absoluten Quantifizierung von Zielen in verschiedensten Proben. Der Workflow ist unkompliziert und leicht zu erlernen, und er liefert unglaublich konsistente und sensitive Ergebnisse”, sagen Drew Capone (Mitte) und Kollegen an der University of North Carolina in Chapel Hill, NC (UNC).
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