dPCR Copy Number Variation (CNV) Probe Assays

• Plus de 200 dosages validés en laboratoire humide ainsi qu’un outil personnalisé pour la conception de dosages in-silico
• La sélection du colorant permet de multiplexer jusqu’à 5 cibles par réaction
• Gène d’intérêt, référence et dosages de référence centromériques disponibles
• Les dosages prêts à l’emploi ont été validés pour une gamme d’échantillons, tels que FFPE, lignées cellulaires et ADNg
• Méthode de dPCR simple et rapide sur le QIAcuity
• Commodité de l’analyse des données de nombre de copies grâce à la QIAcuity Software Suite

Les dPCR CNV Probe Assays permettent une analyse spécifique, exacte, reproductible et facile à interpréter des modifications du nombre de copies pour des gènes individuels ou des régions d’intérêt. Les dosages pour plus de 200 cibles ont été validés par PCR en laboratoire humide et sont marqués comme tels dans la description du dosage.

En outre, il existe un outil de conception personnalisée pour répondre aux besoins en matière de dosage en dehors de l’offre de dosages validés en laboratoire humide.

Les dPCR CNV Probe Assays sont disponibles au format a tube sous forme de dosages prêts à l’emploi à la concentration 20x. Le tube contient la paire d’amorces et une sonde d’hydrolyse à utiliser avec le QIAcuity Probe PCR Kit (ADN cibles), le QIAcuity Digital PCR System et les QIAcuity Nanoplates.

Chaque dosage inclut le choix de cinq sondes d’hydrolyse différentes (fluorophore) : FAM, HEX, ROX, Atto 550 et Cy5. Cette flexibilité permet de mélanger et d’associer des dosages pour l’analyse multiplex de jusqu’à cinq cibles dans une seule réaction de dPCR.

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Excellente performance de dosage

Les dPCR CNV Probe Assays présentent une excellente amplification et séparation du produit entre les groupes de partition négative et positive dans une analyse duplex avec deux concentrations de matrice d’ANDg différentes, (voir graphiques 1D et 2D des réactions duplex pour les dosages KRAS et TERT). Les résultats indiquent qu’une analyse précise des CNV peut être effectuée même à de faibles concentrations d’entrée d’ADNg. Pour les quantités de charge minimale et maximale dans les nanoplaques 8.5k, veuillez consulter l’extension du manuel d’utilisation QIAcuity.

Analyse précise et reproductible du nombre de copies avec la PCR numérique

Le système dPCR QIAcuity hautement reproductible et les dPCR CNV Probe Assays permettent l’analyse de CNV sans avoir besoin de réplicats, ce qui augmente le débit d’échantillons de manière rentable. L’analyse duplex d’un échantillon d’ADNg a donné le nombre de copies par génome prévu pour tous les réplicats (voir Analyse du nombre de copies précise et reproductible dans une réaction duplex). Dans un test de précision analysant une série de dilutions d’ADNg, les dosages présentent une distribution linéaire et une séparation des ensembles excellentes (voir Test de précision de la distribution linéaire dans une série de dilutions).

Analyse du nombre de copies multiplex par dPCR

L’analyse multiplex avec les dPCR CNV Probe Assays augmente le débit et réduit significativement les coûts d’analyse par cible. La possibilité de commander ces dosages avec différents colorants (FAM, HEX, ROX, Atto 550 et Cy5) permet une conception expérimentale flexible et une analyse multiplex de jusqu’à 5 cibles simultanément dans une seule réaction. Les dPCR CNV Probe Assays présentent d’excellentes amplification et séparations des ensembles positifs et négatifs pour 5 dosages multiplexés dans une seule réaction (voir détection CNV dans une réaction 5-plex).

Tous les dPCR CNV Probe Assays sont conçus pour des régions uniques du génome humain. Les dPCR CNV Probe Gene of Interest Assays ciblent les gènes du cancer et liés au cancer très étudiés. Les dPCR CNV Probe Reference Assays et les dPCR CNV Probe Centromeric Reference Assays incluent diverses références avec différents nombres de copies par génome, ce qui permet de sélectionner les références de normalisation optimales pour chaque analyse. En fonction des conditions expérimentales, plusieurs gènes d’intérêt et dosages de référence peuvent être inclus dans les réactions pour un calcul précis du nombre de copies du gène ou de la cible d’intérêt.

Les dPCR Copy Number Probe Assays sont prêts à l’emploi : ajoutez simplement les mélanges de dosage individuels à l’échantillon d’ADN et au mélange principal du QIAcuity Probe PCR Kit, chargez dans la nanoplaque QIAcuity et démarrez le cycle sur l’instrument QIAcuity. Chaque dosage est basé sur une amplification PCR en point final d’une région spécifique de gènes sur le génome humain. Le produit amplifié est détecté avec des sondes d’hydrolyse fluorescente spécifiques à la cible, ce qui aide à assurer une spécificité élevée du dosage.

Vous trouverez ici une description du principe de la réaction de dPCR sur nanoplaque.

La procédure de configuration expérimentale est simple et facile et peut être réalisée dans tout laboratoire utilisant l’instrument dPCR QIAcuity. Pour une analyse plus précise du nombre de copies, nous recommandons de suivre l’isolation de l’ADN génomique de l’échantillon avec une digestion d’enzyme de restriction. La digestion de restriction n’est pas requise pour l’ADN hautement fragmenté (par ex. ADN FFPE ou ADN circulant) ou l’ADNc. Pour effectuer la digestion de restriction directement dans le mélange réactionnel, incluez l’enzyme de restriction recommandée pendant la configuration de la réaction. Il est essentiel d’éviter d’utiliser les enzymes de restriction touchant la région de l’amplicon cible.

La matrice fragmentée est ensuite mélangée avec le mélange principal du QIAcuity Probe PCR Kit prêt à l’emploi et le dPCR CNV Probe Assay et ce mélange est aliquoté dans chaque puits de la préplaque dPCR. Le mélange réactionnel est ensuite bien mélangé par pipetage et transféré dans les puits d’une nanoplaque QIAcuity. Chaque gène ou cible d’intérêt et chaque dosage de référence peut être analysé dans un seul puits dans une réaction multiplex en les combinant avec différents fluorophores.

Après chargement et scellage de la nanoplaque, le programme de thermocyclage recommandé est exécuté sur l’instrument QIAcuity. Le nombre de copies par microlitre est indiqué dans le type d’analyse de quantification absolue de la QIAcuity Software Suite. Pour le calcul du nombre de copies par génome, sélectionnez le type d’analyse des données de nombre de copies dans la QIAcuity Software Suite, et définissez les puits de la nanoplaque pour le gène/la région d’intérêt ou la référence de normalisation. En fonction du protocole de cyclage, les résultats du cycle de dPCR peuvent être analysés dans la suite logicielle QIAcuity après ~ 2 heures.

Les dPCR CNV Probe Assays sont particulièrement adaptés à la détection avec exactitude des altérations ou variations du nombre de copies dans des loci individuels à l’aide d’ADN provenant d’échantillons frais, congelés ou fixés.