miRCURY LNA miRNA PCR Assays

• La sensibilité inégalée permet la quantification des miARN à partir de seulement 1 pg d’ARN total
• Idéal pour les échantillons à faible rendement en ARN, tels que le sérum/plasma, les sections FFPE et les échantillons LCM
• La spécificité élevée distingue les miARN très proches et les miARN matures des précurseurs
• Le protocole rapide et simple en deux étapes dure moins de 3 heures
• La couverture miRBase complète permet le profilage des miARN de tout organisme

Les miRCURY LNA miRNA PCR Assays sont des lots d’amorces de PCR de miARN individuels permettant une quantification des miARN extrêmement sensible et spécifique avec le miRCURY LNA miRNA PCR System. Les amorces d’amplification par PCR sens et antisens sont spécifiques des miARN et optimisés avec la technologie LNA. Les dosages sont disponibles sous forme de tubes ou de plaques avec 200 réactions par tube ou par puits.

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Une sensibilité inégalée

La sensibilité exceptionnelle des miRCURY LNA miRNA PCR Assays est obtenue en combinant une transcription inverse universelle avec des amorces renforcées par LNA et normalisées par T_m. Cette combinaison permet une quantification précise et fiable des miARN individuels à partir de 1 pg d’ARN total entré dans la synthèse initiale de l’ADNc premier brin (voir la figure  Quantification précise à partir de 1 pg de matériel départ d’ARN total).
Par rapport à d’autres systèmes de real-time PCR des miARN qui utilisent des amorces d’ADN tige-boucle ou standard, les amorces renforcées par LNA offrent une sensibilité nettement accrue, en particulier pour les miARN riches en AT (voir la figure  Les amorces renforcées par LNA augmentent considérablement la sensibilité par rapport aux amorces d’ADN).
Les faibles exigences en matière d’échantillons permettent également de quantifier les miARN en utilisant l’ARN total purifié à partir d’échantillons difficiles tels que les échantillons de LCM et le sérum/plasma (voir les figures  Détection de l’expression différentielle des miARN dans les échantillons de LCM à partir de coupes de tissus FFPE et  Différences dans l’expression des miARN entre les échantillons de sérum).

Entièrement validé et optimisé

Tous les miRCURY LNA miRNA PCR Assays validés en laboratoire ont été optimisés pour être aussi sensibles que possible. Plus de 80 % des dosages détectent au moins 5 copies de miARN dans la réaction PCR (voir la figure  Dilution en série de hsa-miR-181a). Les lots d’amorces ont également été validés pour une amplification spécifique de la cible et un signal de fond minimal (voir la figure  Amplification spécifique et sensible des miARN).

La seule plateforme avec une spécificité parfaite

Les miRCURY LNA miRNA PCR Assays sont la seule plateforme de quantification des miARN présentant une spécificité absolue (voir l’étude miRQC publiée dans Nature Methods) et ont obtenu de meilleurs résultats qu’une autre plateforme miRNA qPCR à base de sonde lors des tests de spécificité (voir la figure Test de spécificité avec un système miRNA qPCR à base de sonde). La spécificité parfaite élimine les faux positifs et garantit uniquement des signaux de miARN robustes et fiables.

Discrimination supérieure

L’incorporation de LNA dans les amorces d’amplification par PCR avant et arrière permet de concevoir des dosages capables de distinguer les séquences de miARN qui ne diffèrent que par un seul nucléotide (voir la figure  Discrimination par un seul nucléotide). De plus, les dosages peuvent faire la distinction entre les séquences de miARN matures et les miARN précurseurs.

Rapide, facile et reproductible

Le protocole facile à suivre, d’une durée de 3 heures, vous permet d’enregistrer à la fois du temps et des efforts en laboratoire. En utilisant la même réaction RT comme matrice dans toutes les réactions PCR ultérieures, la procédure est grandement simplifiée par rapport aux systèmes qui nécessitent une synthèse du premier brin spécifique au miARN. Le nombre d’étapes de pipetage est réduit au minimum et les variations techniques sont minimisées. Cela permet d’obtenir une reproductibilité extrêmement élevée d’un jour à l’autre et même d’un site à l’autre.

Les miRCURY LNA miRNA PCR Assays ont été optimisés pour une utilisation avec le miRCURY LNA RT Kit et le miRCURY LNA SYBR Green PCR Kit. L’utilisation d’autres réactifs affectera la qualité des résultats.

Un système unique pour le profilage des miARN

Les miRCURY LNA miRNA PCR Assays offrent la meilleure combinaison de performance et de facilité d’utilisation disponible sur le marché de la real-time PCR des microARN en combinant le RT universel avec l’amplification par PCR LNA (voir la figure  Schéma du smiRCURY LNA miARN PCR System). Le RT universel permet d’utiliser une réaction de synthèse du premier brin d’ADNc comme matrice pour plusieurs dosages de real-time PCR de miARN. Ceci économise des échantillons précieux, réduit la variation technique et fait gagner du temps au laboratoire. En outre, les amorces d’amplification par PCR sens et antisens sont spécifiques du miARN et optimisés par des LNA. Cela donne 1) une sensibilité exceptionnelle et un fond extrêmement bas, permettant une quantification précise de taux de miARN très faibles et 2) des dosages hautement spécifiques permettant de distinguer des séquences de miARN très proches.

Champ opérationnel

Plus de 20 000 dosages sont disponibles, couvrant tous les organismes du miRBase 20. Plus de 1 400 dosages sont pleinement validés en laboratoire humide pour la sensibilité, la spécificité, l’efficacité et le fond sur des échantillons synthétiques et différents échantillons biologiques. Les dosages restants sont validés in silico à l’aide d’un algorithme de conception complet qui assure des dosages améliorés par des LNA spécifiques aux espèces et de haute qualité, avec une sensibilité et une spécificité optimales dans chaque organisme. Cela signifie que plusieurs dosages différents peuvent cibler la même séquence. Au final, le dosage pour chaque espèce est sélectionné en fonction du patrimoine génétique de l’organisme. Si vous travaillez avec de nouveaux miARN, par exemple d’une expérience de NGS, des jeux d’amorces de miARN LNA personnalisés sont également disponibles pour tous les miARN.

Dosages de gènes de référence pour la normalisation

Neuf lots d’amorces de gène de référence sont disponibles, permettant une normalisation des données de haute qualité et de générer des données fiables de nombreux types d’échantillons différents (voir tableau ci-dessous). Ces lots d’amorces de contrôle ciblent de petits ARN non codants endogènes, exprimés de manière constitutive et relativement stable dans différents tissus humains (voir la figure  Niveaux d’expression des gènes de référence dans différents tissus humains). Les gènes de référence de contrôle couvrent une large gamme de valeurs C_q et permettent une normalisation précise et fiable sur divers niveaux d’expression de miARN.
Les lots d’amorces de contrôle ont été validées en tant que gènes de référence pour le miRCURY LNA miRNA PCR System et fonctionnent de manière optimale avec le miRCURY LNA RT Kit et les miRCURY LNA SYBR Green PCR Kits. Il est très important de toujours confirmer l’expression cohérente et invariable d’un gène dans tous les tissus et sous tous les traitements d’une expérience avant de le choisir comme référence. Nous vous recommandons de tester un certain nombre de gènes de référence et d’utiliser des logiciels tels que GeNorm et NormFinder (qui font partie du logiciel GenEx) pour choisir et valider les gènes de référence.
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• La quantification des miARN matures
• La détection des snoRNA