PyroMark Q48 Autoprep

パイロシークエンシングのテンプレート調製を自動化たAll-in-Oneモデル

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PyroMark Q48 Autoprep Instrument

Cat. No. / ID: 9002471

PyroMark Q48 Instrument, multistep pipet, software and documentation

InstrumentCartridgeAccessoriesKitProduct

PyroMark Q48 Autoprep

PyroMark Q48 Cartridge

PyroMark Q48 Discs

PyroMark Q48 Absorber Strips

RNeasy Protect Kit

PyroMark Q48 AutoPrep Starter Kit

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日本での型番とパッケージ内容は、QIAGEN機器総合カタログをご参照ください。

PyroMark Q48 Autoprep は分子生物学実験用です。疾病の診断、治療または予防の目的に使用することはできません。

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Features

マニュアル作業を極力低減した自動化プロトコールを装備
直感的ソフトウェアによる簡単操作
処理数が向上してより使いやすく
長くそして信頼ある解読を目指したベストモデル
複数のプライマーを混合して解読できるマルチプライマーディスペンセイション機能を搭載
定量的ＤＮＡメチル化解析で研究を加速

Product Details

PyroMark Q48 Autoprepはテンプレート調製作業をプロトコールに組み込んだ一歩進んだパイロシークエンサーです。従来モデルのPyroMark Q24 Advancedと比べて2倍の処理能力と新デザインの直感的操作性で、NGSやアレイからの大量データの検定など機能解析に最適なパフォーマンスを発揮します。

Performance

長くそして信頼ある解読のためのアドバンステクノロジー、ソフトウェアそしてケミストリー

PyroMark Q48 Autoprepに採用されたケミストリーとオペレーションアルゴリズムにより、アッセイのリード長を伸ばすだけでなく塩基の解読、変異解析およびメチル化DNAの定量精度を従来モデル（PyroMark Q96 およびPyroMark Q24）に比較して向上をさせました。そしてアドバンステクノロジーは、従来モデルよりバックグラウンドおよび検出シグナル強度の差異を大きくすることで、アッセイのリード長を伸ばし、塩基解読の信頼性を高めました。また解析する配列に依存はしますが、140塩基を超える塩基配列を高精度に定量解読できます。

より多くのSNPおよび変異解析を

カートリッジリザーバーのリザーバー数以上のアッセイが必要な場合、マルチプライマーディスペンセイション機能（MPD）がその制限を拡大することができます。PyroMark Q48 Autoprepのプライマーカートリッジは3つのリザーバーがありますが、もしそれ以上のアッセイを解析したい場合、異なるプライマーを混合して、1つのプライマーカートリッジのリザーバーにセットすることができます。テンプレート調製後、混合したプライマーは自動的にウェルに分注されます。単一のPCRテンプレートが各ウェルにあるため、それに対応するプライマーのみがテンプレートに結合し、その他のプライマーは、結合せずに溶液中で反応しません（参照）。MPD溶液中のプライマーは、プライマー同士の結合やPCRテンプレートの他の領域に結合しないように設計する必要があります。

PyroMark のモデル間におけるアッセイの互換性

これまで設計したパイロシークエンシングアッセイとPyroMark Q48 Autoprep およびAdvanced ケミストリーとの間には、強い互換性があります。各PyroMark 装置のシリーズ間で、既知のミューテーション頻度とメチル化比率をもつサンプルを使用して比較を行なったところ、ほぼ同等のデータが得られたことから、そのアッセイ互換性はモデル間で高いことが示されました（および参照）。さらにシークエンスプライマーから解析したい塩基までの距離は、モデル間で差異はありませんでした。単一シークエンスでの複数個所の多型やDNAメチル化解析をする場合、特に重要となる特長です。

磁気ビーズによるサンプル調製を可能にした新しいディスクデザイン

PyroMark Q48 Discs は、テンプレート調製とパイロシークエンスを単一の装置内で自動処理できるように設計されました。全てのテンプレート調製に必要な試薬は反応が終わったら、サンプルやラン毎に効率的に除去されるために、単一ランでのウェル間または連続するランのディスク間でクロスコンタミネーションのリスクを極力低減できる設計です（参照）。

See figures

The principle of multiple primer dispension (MPD).

Compatibility among PyroMark platforms for mutation analysis.

Compatibility among PyroMark platforms for methylation analysis.

Excluding well-to-well and disc-to-disc cross contamination.

Principle

PyroMark Q48 Autoprepは、ジェネティックおよびエピジェネティック解析において変異の検出や定量を簡便に行うことができる定量的リアルタイムシークエンサーです。このシステムは最大48サンプルを同時に解析するスループットも持ち合わせています。また、装置が1本鎖DNAを自動調整するため、操作性にも優れています。ストレプトアビジンコートの磁気ビーズ（PyroMark Q48 Magnetic Beads）により、ビオチン化したPCR産物の1本鎖を選択的に分離させます。そして最大4種類のシークエンスプライマーも自動で添加されます。より多くのシークエンスプライマーを使用したい場合は、マニュアルで添加させることも可能です。

パイロシークエンシング反応の各ステップ:

ステップ1: DNA断片をPCR増幅し、パイロシークエンスのテンプレートとして使用するためにDNA鎖をビオチン化します。変性後、ビオチン化一本鎖PCRアンプリコンを単離し、シークエンシング用プライマーをハイブリダイズさせます。プライマーをアニーリングさせた一本鎖テンプレートに、酵素類であるDNA polymerase、ATP sulfurylase、luciferase 、apyrase および基質であるAPS（adenosine 5' phosphosulfate）、Luciferin と共にインキュベートします。（"" 参照。）

ステップ2: 反応液にdNTP（deoxribonucleotide triphosphate）を1種類ずつ添加します。テンプレート鎖の塩基に相補するdNTPである場合、DNA polymerase によりシークエンシング用プライマーにdNTPが付加されます。dNTPが取り込まれると、取り込まれたヌクレオチドの量に比例し、定量的にPPi（ピロリン酸）が遊離します。（"" 参照。）

ステップ3: ATP sulfurylase は、反応液に予め含有しているAPS（adenosine 5' phosphosulfate）と遊離したPPi によりATP を生成します。このATP はLuciferase を触媒として、このATPと反応し、Oxyluciferin へと変換され、ATPの量に比例して可視光が発生します。生じた発光は、CCDセンサにより検出され、ピーク波形（パイログラム；Pyrogram）として観察されます。各ピーク（光のシグナル）の高さは、取り込まれたヌクレオチド数に比例します。（"" 参照。）

ステップ4: Apyrase はヌクレオチドを分解する酵素で、反応に使用されなかったヌクレオチドおよびATPを分解します。分解が完了すると、次のヌクレオチドが添加されます。（"" 参照。）

ステップ5: dNTPの添加が連続して行なわれます。基質として通常のdATP（deoxyadenosine triphosphate）の代わりにdATPαS（deoxyadenosine alfa-thio triphosphate）を使用します。これはdATPαS がLuciferase の基質にならず、DNA polymeraseにより効率的に使用されるからです。この連続工程により、相補的なDNA 鎖が伸長され、パイログラムにおける各発光ピークから塩基配列が決定できます。（"" 参照。）

See figures

Principle of Pyrosequencing – step 1.

Principle of Pyrosequencing – step 2.

Principle of Pyrosequencing – step 3.

Principle of Pyrosequencing – step 4.

Principle of Pyrosequencing – step 5.

Procedure

PyroMark Q48 Advancedソフトウェアでランファイルを作成し、USBスティックまたはネットワークを経由して装置本体に転送します。試薬、ヌクレオチドおよびバッファーは装置の画面に示される容量をカートリッジにセットします。ビオチン化したPCR産物とストレプトアビジンコートしたセファロース磁気ビーズを、Q48 Discのウェルに添加し、ディスクおよびアブソーバーストリップを装置にセットします。1本鎖テンプレートの調製やシークエンスプライマーの添加は全自動です。最大3つのシークエンスプライマーまたはマルチプライマーディスペンセ―ション（MPD）ミックスの添加も自動で行なうことができます。オプションとして、手動でのプライマー添加をすれば、さらに多くのアッセイを一度の運転で行なうことができます。

Applications

パイロシークエンスは様々な専門分野での研究アプリケーションに重要な情報を提供します。また薬剤耐性の病原菌研究、遺伝子発現制御におけるDNAメチル化研究、家畜などの有用形質の遺伝マーカーの研究、法医学におけるミトコンドリアDNAの多型研究など、PyroMarkシリーズの装置はジェネティックおよびエピジェネティック研究を力強く加速させます。さらに、パイロシークエンシングは塩基解析の配列検出と定量解析を同時に行なえるため、一度の解析に得られる情報量も多く、さらなる発見を導くことができるかもしれません。

Software

PyroMark A48 Autoprepのソフトウェアは、包括的な解析を可能にします。ソフトウェアにはAQ、SNP、CpGおよびSEQの4つの解析モードを搭載しています。AQモードは、SNPやInDel など構造変異を、各塩基レベルで定量的解析が可能です。これは単一および複数の塩基において、いかなる塩基置換が行なわれても、確実に解析することができます。SNPモードは、特定のSNPやInDel のジェノタイピング解析を行なうことができます。CpGモードは、単一または複数のCpGまたはCpNサイトのメチル化解析を可能にします。またバイサルファイト処理に対するコントロールも用意しております。最後にSEQモードは、未知の配列を解読するのに最適です。

PyroMark Q48 Autoprepソフトウェアは、直感的でユーザーフレンドリーな設計となり、操作性を追求しました。もし、運転中に問題が発生したり、システムがアッセイの矛盾などを検出したときは、ソフトウェアはすぐさまウェルごとの不具合の情報を提供します。そしてWarning Infoボタンが現れ、その警告に対する詳細な情報が提供されます。ここでは対処に関するガイダンスを行ない、さらなる予期しないトラブルを避けられるように設計されています。

Services

Have your throughput demands increased? Do you want to expand your application range or further streamline workflows? Do you need to manage more complex samples? Do you need improved connectivity?

If the answer to any of these questions is yes, then QIAGEN’s trade-in/trade-up program is just right for you!

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Supporting data and figures

Excluding well-to-well and disc-to-disc cross contamination.

Specifications

Features	Specifications
Applications
Instrument dimensions
Connections
Humidity
Kits designed for this instrument
Operating temperature
Overvoltage category
Place of operation
Pollution level
Power
Process temperature
Process time
Samples per run (throughput)
Software
Technology
Weight
Altitude

Resources

Automated Pyrosequencing with integrated template preparation for advanced methylation, mutation and SNP quantification

Download Safety Data Sheets for QIAGEN product components.

This is the latest version of the PyroMark Q48 Autoprep instrument software. The software may only be downloaded by registered users with a registered PyroMark Q48 Autoprep instrument. For updating please follow instructions provided in the user manual chapter 5.4 Upgrading the instrument software. The user manual can be downloaded from the PyroMark Q48 Autoprep webpage.

Shortage of PyroMark Q48 Autoprep Absorber Strips

For use with PyroMark Q48 Autoprep, PyroMark Q24 Advanced, PyroMark Q24, PyroMark Q96 ID and PyroMark Q96 MD systems

FAQ

Verify that the environmental temperature did not change (e.g., air conditioner cycling on or off) and remains under 32°C during the run. Ensure that reagents have been adapted to room temperature prior to the run.

FAQ ID - 3843

The unmethylated and unconverted human control DNA of the EpiTect PCR Control DNA Set allows to check that primers designed for the specific detection of unmethylated and converted DNA (U-converted DNA), and for methylated, converted DNA (M-converted DNA) does not bind to untreated genomic DNA.*

In case bisulfite conversion was not complete, leaving certain unmethylated C residues unconverted, false positives would result if the primer specific for M-converted DNA binds to untreated gDNA.

This control DNA can also be used to check conversion efficiency during bisulfite treatment.

*Summary of principle: Methylation of DNA occurs on cytosine residues, especially on CpG dinucleotides enriched in small regions of DNA. Incubation of target DNA with sodium bisulfite, using, for example, EpiTect Bisulfite Kits, results in conversion of unmethylated cytosine residues into uracil, leaving methylated cytosines unchanged.

FAQ ID -2007

PyroMark instruments offer a range of throughput scales. The PyroMark Q24 can process 1–24 samples in parallel, the PyroMark Q48 Autoprep, 1–48; the PyroMark Q96 ID, 1–96; and the PyroMark Q96 MD, 1–96; or the automation option enables automated processing of ten 96-well plates. The sample processing speed depends on the number of nucleotide dispensations necessary for the programmed analysis. Twenty dispensations take approximately 24 minutes on all instruments; thus, 96 samples are typically processed in 10–100 minutes.

FAQ ID -2215

Typical reading length using pyrosequencing technology is 40−60 bases. However, as with any sequencing technology, the maximum read length will depend on template secondary structure, base content, quality of PCR-product, and other parameters.

Depending on the sequence to be analyzed, highly accurate read lengths of 140 bases or more can be obtained in just a single reaction with the Q48 PyroMark Autoprep.

FAQ ID -2216

All relevant information regarding PyroMark CpG Assay setup can be found on the GeneGlobe website. For the Q24 and Q96, the "Sequence to Analyze" and dispensation order should not be copied manually to create a new assay. Instead, the assay file should be downloaded from the web and opened in the PyroMark CpG software, PyroMark Q96 ID v2.5 (or higher) software, and PyroMark Q24 Software to keep important software settings.

When using the PyroMark CpG assays with the PyroMark Q48, use the "Sequence to Analyze" provided in the "product specification" section to create an assay setup file in the PyroMark Q48 software. This is done by selecting New CpG assay and pasting in the Sequence to Analyze (not the "sequence after bisulfite treatment") into the Sequence Before Bisulfite Treatment field and pressing Create Dispensation order.

FAQ ID -2814

The PyroMark Custom Assay includes a 10x PCR Primer Set (mixture of forward and reverse PCR Primer) and 10x Sequencing Primer. Reagents for performing PCR and pyrosequencing reaction are not included.

FAQ ID -2815

PyroMark CpG Assays are shipped lyophilized at ambient temperatures (20−25°C) and should be stored at −20°C either reconstituted or lyophilized. Repeated freeze−thaw cycles should be avoided. When stored under these conditions, the reconstituted product can be kept for at least 18 months from the date of receipt without reduction in performance.

FAQ ID -2816

The PyroMark CpG Assay is reconstituted as a 10x PCR Primer Set in 550 µl TE, pH 8.0 and the 10x Sequencing Primer is reconstituted in 1175 µl Annealing Buffer if using the PyroMark Q24, 880 µl if using the PyroMark Q96 ID, and 1175 µl if using the PyroMark Q96 MD.

FAQ ID -2817

No, QIAGEN does not design any Custom PyroMark CpG Assay. Customers have the possibility to order pre-designed, genome-wide PyroMark CpG Assays or order a user-designed assay (e.g., with the PyroMark Assay Design Software or assays known from previous projects or from the literature).

FAQ ID -2818

PyroMark CpG Assays are genome-wide, pre-designed methylation assays for pyrosequencing analysis. An optimized design algorithm was used for highly specific assay design and advanced CpG methalytion results.

FAQ ID -2821

QIAamp/DNeasy Kits can be used for DNA isolation, EpiTect Bisulfite Kits for DNA conversion, PyroMark PCR Kit for PCR amplification, EpiTect Control DNA Set for PCR controls, and PyroMark Gold Q24 Reagents or PyroMark Gold Q96 Reagents for the sequencing reaction.

Depending on the platform used, the following reagent kits are required for pyrosequencing:

PyroMark Q96 ID and MD: PyroMark Gold Q96 Reagents
PyroMark Q24: PyroMark Gold Q24 Reagents
PyroMark Q24 Advanced: PyroMark Q24 Advanced Reagents and PyroMark Q24 Advanced CpG Reagents
PyroMark Q48 Autoprep: PyroMark Q24 Advanced Reagents and PyroMark Q24 Advanced CpG Reagents

FAQ ID -2822

Primer sequences for PyroMark CpG Assays are not provided; they are proprietary.

FAQ ID -2823

PyroMark CpG Assay can be ordered in tubes or on 96-well plates. PyroMark CpG Assays, 96 wells, require a minimum order of 24 assays per plate.

FAQ ID -2824

The amplicon length should be short (<200 bp). This is critical especially for DNA from FFPE tissue that is often degraded by the fixation so that short fragments are easier to amplify. Moreover, the DNA suffers from harsh bisulfite treatment and might receive further double strand breaks. Therefore, the amplicon size should be kept as short as possible.

FAQ ID -2825

Usually the sequencing primer is used at 0.3 µM in annealing buffer but some assays might require additional optimization of the sequencing primer concentration.

For PyroMark Q24 and PyroMark Q96 MD, the final concentration of the sequencing primer is 0.3 µM and, for PyroMark Q96 ID, 0.4 µM.

The PyroMark Q48 Autoprep dispenses the sequencing primers for annealing. The final concentration of sequencing primers in a well is 0.8 µM but may be adapted to optimize assays.

FAQ ID -2826

Only the biotinylated primer needs to be HPLC purified, whereas the other primers require standard desalting only.

FAQ ID -2832

In pyrosequencing, the 5' end should be biotinylated, regardless of whether the forward or reverse primer is biotinylated.

FAQ ID -2839

In general, the standard claim for pyrosequencing sensitivity is approximately 5%, which is also published in many papers. The actual sensitivity limit is assay dependent and has to be determined individually.

FAQ ID -2840

In general, dUTP/UNG treatment should work for pyrosequencing to reduce contamination risk with PCR amplicons from previous PCRs.

FAQ ID -2843

PyroMark Control Oligo has a concentration of 20 µM and is delivered in a volume of 50 µl. Two tubes of 10x dilution buffer (2x 1.7 ml) are delivered with the control oligo.

FAQ ID -2846

The recommended Streptavidin Sepharose High Performance beads for pyrosequencing can be ordered at GE Healthcare with the cat. no. 17-5113-01.

The PyroMark Q48 Autoprep protocol uses magnetic streptavidin-coated Sepharose® beads (PyroMark Q48 Magnetic Beads), which bind to the biotinylated PCR strand.

PyroMark Q48 Magnetic Beads can be ordered at QIAGEN with the cat. no. 974203.

FAQ ID -2850

There is no specific PyroMark Assay Design Software user manual available but a so-called Quick Guide can be downloaded from the PyroMark instrument webpage. Furthermore, the software contains a comprehensive online help (accessible via the Help menu or by pressing the “F1” key).

FAQ ID -2851

PyroMark Q24: The mean single peak height is 95 +/- 55 RLU.
PyroMark Q48: The mean single peak height is 70 +/- 40 RLU.
PyroMark Q96 ID: The mean single peak height is 35 +/- 10 RLU.
Pyromark Q96 MD: The mean single peak height should be at least 350 RLU.

FAQ ID -2852

The PyroMark Assay Design and application software do not support PCR setup with a pipetting scheme or PCR cycling conditions. General recommendations on how to setup and optimization of the PCR reaction are contained in the PyroMark PCR Handbook.

FAQ ID -2862

In the range of 3−5 bases can be resolved depending on the sequence context and base. If it is possible, sequencing of a homopolymer of more than 3−5 nucleotides should be avoided by resetting the sequencing primer.

FAQ ID -2871

There are several reasons for a high assay background; the template can form secondary structures that are extended or the primers itself form dimmers that serve as template. Perform accurate sequencing controls (e.g., PCR or sequencing primer only) as recommended in the PyroMark User Manual to observe this kind of background. In addition, an unspecific priming of primer to template or unspecific annealing of sequencing primer to template might also be a background cause. Please check your complete primer design and, if needed, perform a redesign. Try to lower the primer concentration as possible to avoid excess of primer.

FAQ ID -2877

PyroMark IdentiFire Software is compatible with Windows 2000, Windows XP, and Windows 7 (32 bit).

FAQ ID - 3340