PyroMark Q24 Advanced

PyroMark Q24 Advancedは従来のパイロシークエンス法を改善することで、以前よりも優れた検出や定量を実現します。PyroMark Q24 Advancedは新しい試薬、およびソフトウェアの改良によってロングリードに対応し、様々な配列の変異、CpGや CpN部位のメチル化、複合変異の解析、あるいは微生物タイピングのようなde novo シークエンシング・アプリケーションに最適です。

従来の約2倍のロングリードと高い正確性

PyroMark Q24 Advancedは、オペレーションアルゴリズムの改善により、ケミストリー およびリード長とベースコーリングの正確性を有意に増大し、一回のランでより長い シークエンス解析が簡単に行なえます。従来、バックグラウンドノイズおよび解読配列後半のシグナルが弱くなることにより、解読長は制限されていました。PyroMark Q24 Advanceの最新のケミストリーとアルゴリズムはこのバックグラウンドを低下し、その結果リード長と信頼性の増大を実現しました。解析される配列によりますが、わずか一回のPyroMark Q24 Advanced反応で140あるいはそれ以上の塩基を高い精度で読み取れます（図” Long de novo シークエンシング解析”）。

あらゆる部位におけるメチル化解析を実現できるよう改善

PyroMark Q24 Advancedは従来よりもロングリードを行なえることで、より効率的にメチル化定量を実現します。 以前はシークエンシンス用プライマーから離れたメチル化部位の解析が不正確なことがありましたが、より長いリード数と高精度で信頼できるメチル化定量を広範囲で実現します（図”  ロングリードにおける16個のCpG部位を解析”）。

ホモポリマーにおけるシークエンシングの正確性を改善

DNAメチル化解析におけるBisulfite変換はヌクレオチド配列中にPoly Tストレッチをしばしば誘導し、このようなTホモポリマーの直後にあるCpG部位の解析は、以前は非常に困難でした。 PyroMark Q24 Advancedの向上した精度は、8Tヌクレオチドストレッチの後ろおよびその領域内にあるCpG メチル化でも信頼できる定量を実現します（図” 改善されたホモポリマーのメチル化定量”）。

ロングリードにおける変異解析

PyroMark Q24 Advancedはまた、一回のアッセイで複数の多型も高い信頼性で定量できます。SNP（single nucleotide polymorphism）およびその他の変異は互いに近くに位置していないことが多いため、従来のパイロシークエンシングケミストリーでは、解析する各変異で個別のアッセイが必要になることがありました。PyroMark Q24 Advancedの新しいケミストリーは一回のランでより長い配列解析を実現するため、一回のランで二つ以上の変異やSNAの信頼できる解析が可能です（図” ロングリードにおける変異定量解析”）。

パイロシークエンス法は、合成による配列解読（sequencing by synthesis）原理に基づいており、数分で配列解析中にあるターゲット塩基の定量解析が可能です。PyroMark Q24 Advancedは、高い正確性とロングリードでリアルタイムな配列情報を実現する完全統合システムで、複合変異、エピジェネティック研究、耐性菌タイピング、微生物同定の解析に最適です。本システムは、PyroMark Q24装置（ランニングファームウェア3.0以上）、PyroMark Q24 Advanced Software、PyroMark Q24 Advanced Reagents/PyroMark Q24 Advanced CpG Reagents、PyroMark Q24 Vacuum Workstation、PyroMark Control Oligoで構成されています（表参照）。PyroMark Q24 Vacuum Workstation を使用して一本鎖DNAの調製を実現するサンプル調製用製品もお届けしています。

パイロシークエンス法のステップ:

ステップ1：DNAセグメントを増幅し、パイロシークエンス法のテンプレートとして使用するためにDNA鎖をビオチン化します。変性後、ビオチン化一本鎖PCRアンプリコンを単離し、シークエンシング用プライマーをハイブリダイズさせます。プライマーをアニーリングさせた一本鎖テンプレートに、酵素類であるDNA polymerase、ATP sulfurylase、luciferase 、apyrase および基質であるAPS（adenosine 5' phosphosulfate）、Luciferin と共にインキュベートします（図" パイロシークエンシング法の原理 — ステップ 1"）。

ステップ2：次に、反応液にdNTP（deoxribonucleotide triphosphate）を1種類ずつ添加します。テンプレート鎖の塩基に相補するdNTPである場合、DNA polymerase によりシークエンシング用プライマーにdNTPが付加されます。dNTPが取り込まれると、取り込まれたヌクレオチドの量に比例し、定量的にPPi （ピロリン酸）が遊離します（図" パイロシークエンシング法の原理 — ステップ 2"）。
ステップ3：ATP sulfurylase は、反応液に予め含有しているAPS（adenosine 5' phosphosulfate）と遊離したPPi によりATP を生成します。このATP はLuciferase を触媒として、このATPと反応し、Oxyluciferin へと変換され、ATPの量に比例して可視光が発生します。生じた発光は、CCDセンサにより検出され、ピーク波形（パイログラム；Pyrogram）として観察されます。各ピーク（光のシグナル）の高さは、取り込まれたヌクレオチド数に比例します（図" パイロシークエンシング法の原理 — ステップ 3"）。

ステップ4：Apyrase はヌクレオチドを分解する酵素で、反応に使用されなかったヌクレオチドおよびATPを分解します。分解が完了すると、次のヌクレオチドが添加されます（図" パイロシークエンシング法の原理 — ステップ 4"）。

Step 5: dNTPの添加が連続して行なわれます。基質として通常のdATP（deoxyadenosine triphosphate）の代わりにdATPαS（deoxyadenosine alfa-thio triphosphate）を使用します。これはdATPαS がLuciferase の基質にならず、DNA polymeraseにより効率的に使用されるからです。この連続工程により、相補的なDNA 鎖が伸長され、パイログラムにおける各発光ピークから塩基配列が決定できます（図" パイロシークエンシング法の原理 —ステップ 5"）。
 

サンプルから解析までの効率的なワークフロー

適応性の高いPyroMark Q24 Advanced は、エピジェネティクスや遺伝解析のワークフローに取り入れることができ、サンプル調製、バイサルファイト変換、PCR増幅のための斬新なQIAGEN テクノロジーと組み合わせて最高の結果を提供します。非常に信頼性の高い本装置は、変異やCpGあるいはCpN部位のメチル化の塩基配列をベースにした検出／定量を実現します。効率化されたワークフローにより迅速に結果が得られます。

迅速で容易なサンプル調製

シークエンシング用の一本鎖テンプレートをPCR 産物から調製 — PyroMark Q24 Vacuum Workstation を用いて最大24 サンプルを同時に15 分以内で調製できます。ワークステーションは取り扱いが簡単で、実際のマニュアルでの作業は5 分以内です。

パイロシークエンス法を実施する前に、ビオチン標識されたPCR産物が作製されます。このビオチン標識されたPCR 産物はストレプトアビジンでコーティングしたセファロースビーズに結合し、ビーズはVacuum WorkstationのVacuum Tool により捕集されます。ここで十分に洗浄された後、変性され、パイロシークエンス用に最適な一本鎖DNA が調製されます。このテンプレートDNAがシークエンシング用プライマーの入ったパイロシークエンス反応用プレートに移され、プライマーのアニーリングの後、プレートをPyroMark装置にセットします。PyroMark Q24 Advanced ReagentやPyroMark Q24 Advanced CpG Reagentはパイロシークエンス反応用の酵素、ヌクレオチド、基質を含みます：ソフトウェアにより提示される量に従ってこれらを分注用カートリッジにピペットで分注し、装置にセットしてパイロシークエンスを開始します。

パイロシークエンス法は様々な分野での研究アプリケーションでますます重要になってきています。薬剤耐性菌の検出、遺伝子発現制御におけるエピジェネティックなDNAメチル化の役割、家畜の特異的な表現型に対応する遺伝子マーカー、法医学サンプルからのミトコンドリアDNAの多型など、どのアプリケーションを実施するかにかかわらず、PyroMark Q24 Advancedは遺伝子変異やエピジェネティックな変異を解析できる強力で多様性のあるツールです。さらにパイロシークエンス法は配列の検出および定量を行えるため、高解像度の解析が行なえ、新しい発見に繋がります。

使いやすいPyroMark Q24 Advanced Software

PC にインストールしたPyroMark Q24 Advanced Softwareにより、実験結果を包括的に解析できます。ソフトウェアには4種類の解析モード（AQ, SNP, CpG, SEQ）が含まれています。AQモードはSNPやInDel変異（挿入欠失変異）のような様々な変異定量研究に使用できます。本モードは、di-、tri-、tetra-アレリックな変異同様、単一および複数の部位解析に最適です。SNPモードは、SNPやInDel（挿入欠失変異）の遺伝子型解析を実現します。CpGモードは、単一あるいは複数のCpGやCpN部位のメチル化解析を可能にし、Bisulfite処理に対するコントロールが組み込まれています。SEQモードは未知配列のベースコーリングのために使用されます。

使いやすく直感的なPyroMark Q24 Advanced解析ソフトウェアは、ラン解析用に簡便で改善されたツールを新しく提供します。ラン中に問題が発生した場合、あるいはシステムがアッセイとの矛盾を検出した場合に、ソフトウェアが各ウェルに対して特異的な警告情報を発信します（図"Warning information and recommendations"）。 “Warning info” ボタンにより、トラブルシューティングや次のアッセイでその問題を回避するための提言と共に警告に関する追加情報が得られるようになりました。

PyroMark Assay Design Software を用いたフレキシブルで簡単なパイロシークエンス法アッセイデザイン

PyroMark Assay Design Software 2.0 は、パイロシークエンス解析用のPCR およびシークエンスプライマーの簡単なデザインを実現します。アッセイはPyroMark の全機種用に最適化されています。