PyroMark PCR Kit

パイロシークエンス解析に最適なDNAテンプレートのPCR増幅

Features

  • 様々なサンプルからゲノムDNAおよびBisulfite変換DNAを高い特異性で増幅
  • パイロシークエンス解析用に至適化済みのキット
  • 至適化不要で高収量のPCR産物
  • 室温でセットアップできる簡便なマスターミックス
  • 至適化済みのプロトコール

Product Details

PyroMark PCR Kitはパイロシークエンス解析用に特別に至適化され、DNAテンプレートを変異検出、SNP検出、メチル化解析、シークエンシングなど様々なアプリケーション用に高い特異性で均一に増幅します。本キットは、特異性の高い増幅用に至適化済みのPyroMark Reaction BufferとHotStarTaq DNA Polymeraseからなる簡便なマスターミックスフォーマットでお届けします。さらに増幅困難なテンプレート(GCリッチなど)用に最適なQ-Solutionも入っています。PyroMark PCR KitにはまたCoralLoad Concentrateが同梱されており、パイロシークエンス解析において信頼できる結果が得られます。CoralLoad Concentrateには2種類のマーカー色素が入っているので、パイロシークエンス解析を行なう前にPCR産物をすぐにゲルにロードしチェックできます。

Performance

最適な割合のカリウムとアンモニウム塩を含有するPyroMark PCR Master Mixは、プライマーとテンプレートの特異的なアニーリングを促進すると同時に非特異的なアニーリングを抑制します。テンプレート量が非常に少ない場合でも、最大収量の特異的産物が得られます(図 " PyroMark PCR Kitで優れた結果")。このように至適化されたテンプレートの増幅によってPyrogramのピークが高くなり、パイロシークエンス法の結果がさらに信頼できるものとなります(図 " パイロシークエンス法に至適化されたPCR")。

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Principle

PyroMark PCR Master Mix

PyroMark PCR Kitは、パイロシークエンス解析に最適なDNAテンプレートのPCR増幅を可能にします。全てのPCRサイクルのアニーリングステップ中、画期的なバッファー成分により、特異的なプライマー結合の比率が非特異的な結合に比べて高くなります。ゲノムDNAをBisulfite処理すると、非メチル化シトシンはウラシルに変換され、主に3種類の塩基で構成されるDNAがつくられます。このPCRバッファーは、KClと(NH4)2SO4のユニークな配合比により、従来のPCRバッファーに比べ幅広いアニーリング温度やMg2+濃度の範囲で厳密なプライマーアニーリング条件を実現します。塩をバランスよく配合したPyroMark PCR Kitのユニークなマスターミックスは、特異的なプライマー結合を確実にし、ミスプライミングを防ぎます。この特殊な配合組成は、ビオチン化プライマーの過剰な蓄積も防ぎ、パイロシークエンス反応を妨害する可能性があるアーティファクトの発生を最小限に抑えます。高収量の特異的なPCR産物が得られることで、パイロシークエンス法の結果が信頼できるものになります。 

各PCRサイクルのアニーリングステップの間、このバッファー組成により、プライマーの非特異的結合に対する特異的結合の比が高くなります(図 " プライマーのアニーリングにおける特異性が増加")。本製品のPCRバッファーは、独自のバランスでKClと(NH4)2SO4を含んでおり、従来のPCRバッファーと比べて幅広い範囲のアニーリング温度とMg2+ 濃度条件で、厳密なプライマーアニーリングが可能になります。アニーリング温度やMg2+ 濃度を変化させてのPCR最適化実験は、通常は必要ありません。

HotStarTaq DNA Polymerase

マスターミックス中のHotStarTaq DNA Polymeraseは、QIAGENの組み換えTaq DNA Polymerase(94 kDa)を改良しています。HotStarTaq DNA Polymeraseは、常温では不活性状態でポリメラーゼ活性はありません。この特性により低温でのミスプライムによる増幅産物やプライマーダイマーの形成を抑制できます。HotStarTaq DNA Polymerase は、95 ℃、15分間のインキュベーションステップで活性化され、このステップは既存のサーマルサイクリングのプログラムに容易に導入できます。HotStarTaq DNA PolymeraseはPCRの特異性を高め、特異性の高いPCR産物の収量が増加します。全ての反応成分は室温で混和できるのでPCRセットアップが迅速かつ簡単に行なえます。

Q-Solution

PyroMark PCR Master Mixには画期的なPCR添加剤であるQ-Solutionが添付されており、DNAの変性環境を改善することで、増幅困難なテンプレートの増幅を可能にします。このユニークな試薬により、高度な二次構造を持つテンプレートやGCリッチなテンプレートなどの増幅反応を促進します。DMSOのような汎用されているPCR添加物と異なり、Q-Solutionはどのようなプライマーテンプレートでも一定の濃度で作用し、毒性もなく、PCR純度は保証されています。Q-Solution存在下で増幅したPCRフラグメントはパイロシークエンスで良好な結果が得られます。

CoralLoad Concentrate

2種類のマーカー色素とゲルローディング試薬が入った CoralLoad Concentrateがキットに添付されています(図 " CoralLoad Concentrate")。CoralLoad Concentrateを用いた際は、PCR産物を直接アガロースゲルにロードでき、ゲルローディングバッファーおよびマーカー色素を前もって添加する必要がありません。CoralLoad ConcentrateをPCRに添加しても、増幅感度や特異性に影響しません。CoralLoad Concentrate存在下で増幅したPCRフラグメントはパイロシークエンスで良好な結果が得られます。

 

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Procedure

PyroMark PCR Kit は、パイロシークエンス解析用に至適化されたDNAテンプレートのPCR増幅を実現します。テンプレートDNAを便利なPyroMark PCR Mastermix、Q-Solution、CoralLoad concentrate、および増幅プライマー(一方はビオチン化されているもの)と混合します。HotStarTaq DNA Polymerase は室温では不活化されているため、氷上で反応セットアップを行なう必要はありません。

Applications

パイロシークエンス法は様々な分野でますます重要になってきています。パイロシークエンス法は遺伝子変異やエピジェネティックな変異のパワフルで多様な解析を可能にし、病原体における薬剤耐性や遺伝子発現制御におけるエピジェネティックなDNAメチル化の役割、家畜における特定の表現型のための遺伝子マーカー、法医学サンプルのミトコンドリアDNA多型を調べることが可能です。PyroMark PCR Kitは、パイロシークエンス解析のための信頼できる特異性高いテンプレートアンプリコンを作製するために必要な試薬です。

Supporting data and figures

Resources

Publications

Y chromosomal STR analysis using Pyrosequencing technology.
Edlund H; Allen M;
Forensic Sci Int Genet; 2009; 3 (2):119-24 2009 Jan 6 PMID:19215881
Amelogenin sex determination by pyrosequencing of short PCR products.
Tschentscher F; Frey UH; Bajanowski T;
Int J Legal Med; 2008; 122 (4):333-5 2008 Mar 20 PMID:18351373
Identification of mammal species using species-specific DNA pyrosequencing.
Karlsson AO; Holmlund G;
Forensic Sci Int; 2007; 173 (1):16-20 2007 Feb 28 PMID:17331687
More on contamination: the use of asymmetric molecular behavior to identify authentic ancient human DNA.
Malmström H; Svensson EM; Gilbert MT; Willerslev E; Götherström A; Holmlund G;
Mol Biol Evol; 2007; 24 (4):998-1004 2007 Jan 25 PMID:17255122
Forensic mitochondrial coding region analysis for increased discrimination using pyrosequencing technology.
Andréasson H; Nilsson M; Styrman H; Pettersson U; Allen M;
Forensic Sci Int Genet; 2006; 1 (1):35-43 2006 Nov 29 PMID:19083726
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