miScript II RT Kit
miScript PCR Systemを用いてmiRNAを含むトータルRNAの逆転写反応
Features
- 高感度で特異的にmiRNAを検出するためのcDNAを調製
- 一回の cDNA 合成で網羅的な miRNA の検出を実現
- 同一cDNA からmiRNA とmRNA を定量
- 同一cDNA からmatureおよびprecursor miRNAを定量
- 独自の合成RNAにより逆転写効率を評価
Product Details
miScript II RT Kitは、miRNAの検出および定量を実現するmiScript PCR Systemに不可欠なキットです。miScript II RT Kitを用いて調製したcDNAは、miScript SYBR Green PCR Kitと、PCR アレイ（miRNomeあるいはPathway-Focused miScript miRNA PCR Arrays）あるいは適切なアッセイ（miRNAあるいはその他のnoncoding RNAのmiScript Primer Assays、precursor miRNAのmiScript Precursor Assays、またはmRNA用のQuantiTect Primer Assay）を用いるリアルタイムPCRのテンプレートとして使用されます。
Performance
miScript II RT KitとmiScript PCRシステムの構成キットとを組み合わせて、miRNAの検出および定量を高い感度と特異性で実現します。ほとんどのmiRNAが低レベルで発現しているので、信頼性の高いデータを確保するためには感度が非常に重要です。miScript PCR Systemは、高感度、広いダイナミックレンジ、そして一貫して高い増幅効率を提供します。miScript PCR Systemの高いパフォーマンスにより、技術的および生物学的な繰り返し実験間で、再現性のある結果が最初の試みで得られます（図 " 技術的および生物学的な繰り返し実験間で再現性のある結果"を参照 ）。
高い特異性
多くのmiRNAアイソフォーム・ファミリーでは、わずか1塩基のみが異なっています。このことがmiRNA定量を困難にしています。しかし、miScript PCR Systemは非常に類似したアイソフォームをわずか1塩基の違いでさえ明確に判別することができます（表参照）。
| miRNA配列 | |
| Let-7b | UGAGGUAGUAGGUUGUGUGGUU |
| Let-7c | UGAGGUAGUAGGUUGUAUGGUU |
| miR-98 | UGAGGUAGUAAGUUGUAUUGUU |
| Let-7d | AGAGGUAGUAGGUUGCAUAGUU |
| Let-7e | UGAGGUAGGAGGUUGUAUAGUU |
| Let-7a | UGAGGUAGUAGGUUGUAUAGUU |
| Let-7f | UGAGGUAGUAGAUUGUAUAGUU |
| Let-7g | UGAGGUAGUAGUUUGUACAGUU |
| Let-7i | UGAGGUAGUAGUUUGUGCUGUU |
| PCRで使用したcDNA | Let-7b | Let-7c | miR-98 | Let-7d | Let-7e | Let-7a | Let-7f | Let-7g | Let-7i |
| Let-7b | 100.00 | 1.78 | 0.00 | 0.00 | 0.00 | 0.01 | 0.00 | 0.00 | 0.01 |
| Let-7c | 0.54 | 100.00 | 0.00 | 0.00 | 1.01 | 0.12 | 0.00 | 0.00 | 0.00 |
| miR-98 | 0.00 | 0.21 | 100.00 | 0.06 | 0.01 | 0.05 | 0.00 | 0.01 | 0.13 |
| Let-7d | 0.05 | 0.02 | 0.00 | 100.00 | 0.00 | 0.38 | 0.00 | 0.00 | 0.01 |
| Let-7e | 0.05 | 0.01 | 0.00 | 0.02 | 100.00 | 0.23 | 0.00 | 0.00 | 0.01 |
| Let-7a | 0.07 | 0.64 | 0.00 | 0.54 | 3.86 | 100.00 | 0.06 | 0.04 | 0.02 |
| Let-7f | 0.55 | 0.12 | 0.01 | 0.11 | 0.03 | 1.05 | 100.00 | 0.14 | 0.13 |
| Let-7g | 0.58 | 0.17 | 0.01 | 0.08 | 0.00 | 0.04 | 0.01 | 100.00 | 0.17 |
| Let-7i | 0.13 | 0.02 | 0.01 | 0.02 | 0.00 | 0.01 | 0.00 | 0.10 | 100.00 |
See figures
Principle
miScript PCR Systemは SYBR Green をベースにしたリアルタイム PCR を用いて、miRNAの定量とプロファイリングを高い感度と特異性で実現します。miScript PCR Systemは、RNAをcDNAに変換するステップと 、続くリアルタイムPCRによりmiRNAを検出するステップをすべてカバーします。
miScript PCR Systemの製品構成：
miScript II RT Kit デュアルバッファーシステム
miScript II RT KitにはmiScript Reverse Transcriptase Mix、10x miScript Nucleics Mix、5x miScript HiSpec Buffer、5x miScript HiFlex Bufferが入っています。miScript Reverse Transcriptase Mixはpoly（A）ポリメラーゼと逆転写酵素の最適なブレンドです。miScript Nucleics MixにはdNTPs、rATP、oligo-dT primer、internal synthetic RNA control（miRNA reverse transcription control [miRTC]） が入っています。 miRTCはmiScript miRNA PCR Arraysを用いたプロファイリング実験中の逆転写反応のパフォーマンスを評価するために使用します（詳細はmiScript miRNA PCR Array Handbookを参照）。
miScript II RT Kitに入っている二種類のバッファー、miScript HiSpec BufferおよびmiScript HiFlex Bufferにより、リアルタイムPCRを用いたmiRNA定量における特有なニーズを満たすことができます（図" miScript II RT Kit バッファー"参照）。miScript HiSpec Bufferは、miScript miRNA PCR ArraysおよびmiScript Primer Assayを用いたmature miRNAのプロファイリングと定量で最適な結果が得られるように配合されています。miScript HiFlex Bufferは、低スループットなmiRNAの定量、さらにmiRNA、mRNA、precursor miRNAなどのさまざまなRNA種を同一サンプルから定量する際に最適です。
miScript HiSpec Bufferを用いた逆転写反応
miScript HiSpec Bufferを用いて行なわれる逆転写反応は、mature miRNAおよびmiScript PCR ControlのターゲットをcDNAに選択的に変換します。Mature miRNAはpoly（A）ポリメラーゼによりポリアデニル化され、oligo-dTプライマーによりcDNAに逆転写されます（図 " miScript HiSpec Bufferを用いたcDNAへのmature miRNAの選択的変換"を参照）。ポリアデニル化と逆転写反応は同一チューブ中で並行して行なわれます。oligo-dTプライマーは3' degenerate anchor と5' 末端にuniversal tag sequenceを持ち、リアルタイムPCRステップでmature miRNAの増幅を行ないます。miScript Primer AssayはmiScript SYBR Green PCR Kitと組み合わせて使用し、リアルタイムPCRによるmature miRNA定量を高い感度と特異性で実現します。ポリアデニル化およびuniversal tag付加の組み合わせにより、miScript Primer AssayがゲノムDNAを検出することはありません。
miScript HiFlex Bufferを用いた逆転写反応
miScript HiFlex Bufferを利用した逆転写反応はすべてのRNA種をcDNAに変換します（図" miScript HiFlex Bufferを用いてすべてのRNA種をcDNAに同時変換"を参照）。mature miRNAはpoly（A） ポリメラーゼによりポリアデニル化されて、oligo-dTプライマーによりcDNAに逆転写されます。ポリアデニル化と逆転写反応は同一チューブ中で並行して行なわれます。oligo-dTプライマーは3' degenerate anchor と5' 末端にuniversal tag sequenceを持ち、リアルタイムPCRステップでmature miRNAの増幅を行ないます。miScript Primer AssayはmiScript SYBR Green PCR Kitと組み合わせて使用し、リアルタイムPCRによるmature miRNAの定量を実現します。ポリアデニル化およびuniversal tag付加の組み合わせにより、miScript Primer AssayがゲノムDNAを検出することはありません。oligo-dTとランダムプライマーにより、他のすべてのRNA種（precursor miRNA、他のnoncoding RNA、mRNA）もまたcDNAに変換されます。これらのRNAのリアルタイムPCR検出は、適切なアッセイ（たとえばnoncoding RNA検出にmiScript Primer Assay、 precursor miRNA検出に miScript Precursor Assay、mRNA検出にQuantiTect Primer Assay）を miScript SYBR Green PCR Kitと組み合わせて行ないます（図" miScript HiFlex Bufferを用いてすべてのRNA種をcDNAに同時変換"を参照）。
See figures
Procedure
逆転写反応は容易に行なえます。miRNAを含むトータルRNAをスタートサンプルとして逆転写反応に使用します。逆転写反応は、37℃で１時間のインキュベーションと続く不活化のためにの短時間の95℃インキュベーションによる簡単な手順で行われます。
Applications
miScript II RT KitはmiScript PCRシステムの一部分として、次のようなアプリケーションに使用します：
Supporting data and figures
miScript II RT Kit buffers.
Two buffers are supplied with the miScript II RT Kit. Use miScript HiSpec Buffer for cDNA synthesis to enable either mature miRNA profiling (using miScript miRNA PCR Arrays) or mature miRNA quantification using individual miScript Primer Assays. Use miScript HiFlex Buffer for cDNA synthesis to enable quantification of mature miRNA, precursor miRNA, noncoding RNA (ncRNA), and/or mRNA from the same cDNA. cDNA prepared using either miScript HiSpec Buffer or miScript HiFlex Buffer can be used with miScript PCR Controls.
Resources
Safety Data Sheets (1)
FAQ
What is the sequence of the miScript Universal Primer?
Are any of the miScript II RT Kit components interchangeable with the miScript Plant RT Kit components?
Is the expression level of miRNA precursors lower compared to that of mature miRNAs?
What is in the HiSpec Buffer that selectively synthesizes cDNA from mature miRNAs ONLY?
Can the miScript II RT Kit be used to quantify plant miRNAs?
Can I use total RNA for the miRNA PCR Arrays or Assays?
Can the miScript II RT Kit be used to quantify piRNAs?