PyroMark Q24

パイロシークエンス法を用いたメチル化定量解析、配列変異解析、微生物同定

Features

  • メチル化解析とSNPタイピングを1回のアッセイに組み合わせ可能
  • アレルおよびメチル化状態を確実に定量
  • 配列情報から、まれな変異を発見
  • 1 ~ 24 サンプルをわずか15分で解析可能
  • 省スペースを実現するコンパクトな検出装置

Product Details

PyroMark Q24 は配列情報を基にした定量解析が可能なシークエンシングプラットフォームです。PyroMark Q24 はCpG メチル化、SNP、挿入/欠失、STR、遺伝子コピー数の変動、微生物同定と抵抗性のタイピングに非常に有用なツールです。

Performance

エピジェネティクス研究に最適な検出ツール

パイロシークエンスシステムはQIAGEN のエピジェネティクス関連製品と使用することで、正確で高感度なメチル化状態の定量を実現します(図 " MLH1遺伝子のCpGメチル化解析") 。低レベルで存在する異常なDNAメチル化パターンの検出や新規の変異の同定もできます。PyroMark Q24には、Bisulfite処理の変換効率確認やCpGメチル化解析に必要なソフトウェアパッケージが含まれています。

複数のCpG部位を個別に定量

様々な腫瘍における各種の遺伝子発現を研究する場合、個々のCpG部位の解析は極めて重要です(図 " RASSF1A 遺伝子のCpGメチル化パターン")。従来の方法によるデータは解像度が低いため、十分な解析ができませんでしたが、パイロシークエンス法はこの問題点を克服し、単一のCpG部位や複数のCpG部位のメチル化パターンの単一の変化も高精度で解析できます。

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Principle

パイロシークエンス法は、合成による配列解読 (sequencing by synthesis) 原理に基づいており、数分でターゲット塩基の定量解析が可能です。PyroMark Q24 はリアルタイムにシークエンス情報を提供し、エピジェネティクス研究や遺伝解析に最適な統合システムです。PyroMark Q24機器と組み合わせて、PyroMark Q24 Vacuum Workstation、PyroMark Q24 Software、PyroMark Gold Q24 Reagents、PyroMark Control Oligo、PyroMark Q24 Validation Oligo がを使用します(表を参照)。PyroMark Q24 Vacuum Workstation を使用して一本鎖DNAの調製を実現するサンプル調製用製品もお届けしています。

関連製品郡 製品説明
PyroMark Q24 変異およびメチル化の定量解析用シークエンス装置
PyroMark Q24 Vacuum Workstation 1本鎖DNAの調製を最大24サンプル同時に行なうワークステーション
PyroMark Q24 Software 解析用ソフトウェア; 2 種類の解析モードを提供(CpG 解析およびアレル定量)
PyroMark Q24 Gold Q24 Reagents 酵素、基質、ヌクレオチド
PyroMark Q24 Control Oligo システムの適切な設置と操作を評価するためのコントロール
PyroMark Q24 Validation Oligo システムの性能を確認するためのコントロール
PyroMark Q24 Tests
遺伝子解析に最適なプラットフォーム

遺伝子解析には、変異およびSNPタイピングを含むゲノムDNAの差異を解析するための様々なアプリケーションが含まれています。PyroMark Q24 は遺伝子のどのような変異解析も高い精度と感度で実現し、混在する細胞集団におけるアレルの種類を定量できます。QIAGENも、パイロシークエンス法により特定の特定の遺伝子変異を解析するための至適化・検証済み研究専用テストを提供しています。

Pyrosequencing反応の実験ステップ

ステップ1:DNAセグメントを増幅し、パイロシークエンス法のテンプレートとして使用するためにDNA鎖をビオチン化します。変性後、ビオチン化一本鎖PCRアンプリコンを単離し、シークエンシング用プライマーをハイブリダイズさせます。プライマーをアニーリングさせた一本鎖テンプレートに、酵素類であるDNA polymerase、ATP sulfurylase、luciferase 、apyrase および基質であるAPS(adenosine 5' phosphosulfate)、Luciferin と共にインキュベートします(図 " パイロシークエンシング法の原理 — ステップ 1")。

ステップ2:次に、反応液にdNTP(deoxribonucleotide triphosphate)を1種類ずつ添加します。テンプレート鎖の塩基に相補するdNTPである場合、DNA polymerase によりシークエンシング用プライマーにdNTPが付加されます。dNTPが取り込まれると、取り込まれたヌクレオチドの量に比例し、定量的にPPi (ピロリン酸) が遊離します(図 " パイロシークエンシング法の原理 — ステップ 2")。

ステップ3:ATP sulfurylase は、反応液に予め含有しているAPS と遊離したPPi によりATP を生成します。このATP はLuciferase を触媒として、このATPと反応し、Oxyluciferin へと変換され、ATPの量に比例して可視光が発生します。生じた発光は、CCDセンサにより検出され、ピーク波形(パイログラム;Pyrogram)として観察されます。各ピーク(光のシグナル)の高さは、取り込まれたヌクレオチド数に比例します(図 " パイロシークエンシング法の原理 — ステップ 3")。

ステップ4:Apyrase はヌクレオチドを分解する酵素で、反応に使用されなかったヌクレオチドおよびATPを分解します。分解が完了すると、次のヌクレオチドが添加されます(" パイロシークエンシング法の原理 — ステップ 4")。

ステップ5:dNTPの添加が連続して行なわれます。基質として通常のdATP(deoxyadenosine triphosphate)の代わりにdATPαS(deoxyadenosine alfa-thio triphosphate)を使用します。これはdATPαS がLuciferase の基質にならず、DNA polymerase により効率的に使用されるからです。この連続工程により、相補的なDNA 鎖が伸長され、パイログラムにおける各発光ピークから塩基配列が決定できます(" パイロシークエンシング法の原理 — ステップ 5")。

サンプルから解析までの効率的なワークフロー

適応性の高いPyroMark Q24 は、エピジェネティクスや遺伝解析のワークフローに取り入れることができ、サンプル調製、Bisulfite変換、PCR増幅のための斬新なQIAGEN テクノロジーと組み合わせて最高の結果が得られます。非常に信頼性の高い本装置は変異およびCpG部位の塩基配列の検出/定量を実現します。効率化されたワークフローにより迅速に結果が得られます。

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Procedure

迅速で容易なサンプル調製 

シークエンシング用の一本鎖テンプレートをPCR産物から調製 — PyroMark Q24 Vacuum Workstation を用いて最大24 サンプルを同時に15 分以内で調製できます。ワークステーションは取り扱いが簡単で、実際のマニュアルでの作業は5分以内です。

パイロシークエンシングの前に、ビオチン化PCR産物を調製します。このビオチン化PCR産物をストレプトアビジンでコーティングされたセファロースビーズに結合させます。Vacuum WorkstationのVacuum Toolを用いてビーズを捉え、十分に洗浄した後変性し、パイロシークエンシング用の一本鎖DNAを調製します。このテンプレートDNAをシークエンシングプライマーを含むパイロシークエンシング反応プレートに入れ、プライマーアニーリングの後、プレートをPyroMark 装置にセットします。PyroMark Gold reagentは酵素、ヌクレオチド、パイロシークエンス反応の基質を含んでいます。この試薬をソフトウェアが指示する量に従い分配チップまたはカートリッジに分注し、パイロシークエンシング用の機器にセットします。

Applications

パイロシークエンス法は様々な分野でのアプリケーションでますます重要になってきています。薬剤耐性菌の検出、遺伝子発現制御におけるエピジェネティックなDNAメチル化の役割、家畜の特異的な表現型に対応する遺伝子マーカー、法医学サンプルからのミトコンドリアDNAの多型など、どのアプリケーションを実施するかにかかわらず、PyroMark Q24は遺伝子変異およびエピジェネティックな変異を解析する強力で適応性のあるツールです。さらにパイロシークエンス法は配列検出および定量を行なうので高解像度の解析が行なえ、新しい発見に繋がります。

Software

Easy-to-use PyroMark Q24 software
PyroMark Q24 software, installed on a PC, enables comprehensive analysis of your results. The software contains two analysis modes: CpG and AQ (allele quantification). Both modes can be used to analyze samples on the same plate, enabling different types of samples to be run at the same time. The AQ mode can be used for analyzing single and multivariable positions, as well as di-, tri- , and tetra- allelic mutations. The CpG mode enables analysis of multiple consecutive CpG sites and provides a built-in control for the bisulfite treatment.

Flexible and simple Pyrosequencing assay design using PyroMark Assay Design Software
PyroMark Assay Design Software 2.0 ensures easy design of PCR and sequencing primers. The assays are optimized for use with all PyroMark instruments.

Supporting data and figures

Specifications

FeaturesSpecifications
Instrument dimensions
接続
Applications
Humidity
Kits designed for this instrument
Overvoltage category
Operating temperature
Place of operation
Chemical resistance
Pollution level
Power
Process temperature
Process time
Samples per run (throughput)
ソフトウェア
Technology
重量
Altitude

Resources

Publications

Genetic diagnostics of functional variants of the human dopamine D2 receptor gene.
Doehring A; Kirchhof A; Lötsch J;
Psychiatr Genet; 2009; 19 (5):259-68 2009 Oct PMID:19512960
Assessing combined methylation-sensitive high resolution melting and pyrosequencing for the analysis of heterogeneous DNA methylation.
Candiloro IL; Mikeska T; Dobrovic A;
Epigenetics; 2011; 6 (4):500-7 2011 Apr 1 PMID:21364322
Cell specific patterns of methylation in the human placenta.
Grigoriu A; Ferreira JC; Choufani S; Baczyk D; Kingdom J; Weksberg R;
Epigenetics; 2011; 6 (3):368-79 2011 Mar 1 PMID:21131778
CpG island hypermethylation of the neurofibromatosis type 2 (NF2) gene is rare in sporadic vestibular schwannomas.
Kullar PJ; Pearson DM; Malley DS; Collins VP; Ichimura K;
Neuropathol Appl Neurobiol; 2010; 36 (6):505-14 2010 Oct PMID:20831745
Systematic cross-validation of 454 sequencing and pyrosequencing for the exact quantification of DNA methylation patterns with single CpG resolution.
Potapova A; Albat C; Hasemeier B; Haeussler K; Lamprecht S; Suerbaum S; Kreipe H; Lehmann U;
BMC Biotechnol; 2011; 11 :6 2011 Jan 14 PMID:21235780

FAQ

What are the differences between new PyroMark Q24 Advanced reagents chemistry and PyroMark Q24 Gold reagents?

The PyroMark Q24 Advanced reagent kit contains an improved enzyme and substrate mix and a new annealing buffer for the new adapted annealing procedure (adapted reaction volume of 20 µl and adapted annealing protocol). Moreover, the kit also contains binding buffer and the dATPalpha is half concentrated.

FAQ ID -3165
How does the built-in QC control for complete bisulfite conversion of DNA work on PyroMark Q24?

Data generated with the methylation analysis software (detection and quantification of CpG sites) on PyroMark Q24 contains unique features that act as quality control for complete bisulfite conversion of DNA. When the assay encounters a C not followed by a G (C unmethylated), that C should be fully converted to T if the bisulfite treatment upfront was successful. Subsequently, it should be presented in the pyrogram as T = 100%. This acts as a useful quality control for full conversion of unmethylated C residues during bisulfite treatment and PCR.

FAQ ID -2095
What is the use of the PyroMark Q24 Validation Oligo?
The PyroMark Q24 Validation Oligo was developed to check the performance of the PyroMark Q24 system. It consists of two biotinylated oligonucleotides that only differ in one position (A or G) of the sequence. By mixing different proportions of the two oligonucleotides in replicates the linearity, bias and reproducibility of the system can be determined.
FAQ ID -2855
How do I perform the PyroMark Q24 Advanced upgrade?

The upgrade can be performed by the user since it only requires installation of the application software and download and installation of the new firmware according to instruction in the Q24 user manual. A service engineer will not be required onsite for the upgrade.

FAQ ID -3163
Is it possible to use PyroMark Q24 Advanced reagents on PyroMark Q24 system?

PyroMark Q24 Advanced reagents should only be used in combination with PyroMark Advanced system. Usage of these reagents on PyroMark Q24 system will result in decreased pyrosequencing performance and low signals.

FAQ ID -3160
We recently changed the OS from Windows XP to Windows 7. When re-installing software Pyromark Q24 2.0.6, it fails to analyze the results. Any suggestions?

Please install software 2.0.7, which is compatible with Windows 7, 64 and 32 bit.

FAQ ID - 3621
What is the amplicon length of the PyroMark CpG LINE assay?
The amplicon length of the PyroMark CpG LINE-1 PCR product is about 146 bp. for PyroMark Q24 and PyroMark Q96 MD.
2856
Does the PyroMark LINE assay target all LINE sequences?
The PyroMark assay is designed to cover LINE-1 retrotransposable elements in the genome. Those differ slightly in sequence and it might be that not all are picked up by our LINE-1 assay. The intention of the assay is to cover as many as possible of the LINE-1 sequences.
2860
What region of LINE gets targeted by the assay for PyroMark Q96 MD or PyroMark Q24?

The PyroMark Q96 CpG LINE-1 for PyroMark Q96 MD is designed to target four CpG sites in positions 331 to 305 (GenBank accession no X58075). The PyroMark Q24 CpG LINE-1 assay for PyroMark Q24 targets three CpG sites in positions 331 to 318 (GenBank accession no X58075). The target region is human LINE-1 transposon DNA consensus sequence.

2857
How long does a single run on the PyroMark Q24 take?

The estimated dispensation time is 1 min/nucleotide.

FAQ ID -2096
How accurate and reliable is PyroMark Q24 in mutation analysis?

PyroMark Q24 uses pyrosequencing technology for mutation analysis and provides a built-in quality control in each run. By sequencing nucleotides flanking the mutation of interest, the researcher gets confirmation that the assay was made at the correct position. In addition, blank dispensations are included in the assay providing a negative control of the run. 

FAQ ID -2094
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