miRCURY LNA miRNA Detection Probes

in situハイブリダイゼーション（ISH）またはノーザンブロッティングによる高感度かつ特異的なmiRNA検出

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適切なターゲット特異的アッセイおよびパネルを探すか、またはターゲットをカスタムデザインし、お客様のご興味のある生物学的ターゲット評価にお使いください。

miRCURY LNA miRNA Detection Probe (1 nmol)

Cat. No. / ID: 339111

1 nmol miRCURY LNA miRNA Detection Probe with option of different labels, provided in single-tube format

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ProductBuffer

miRCURY LNA miRNA Detection Probe (1 nmol)

miRCURY LNA miRNA Detection Probe (10 nmol)

miRCURY LNA miRNA ISH Buffer Set (FFPE)

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miRCURY LNA miRNA Detection Probesは分子生物学的アプリケーション用であり、疾病の診断、予防、あるいは治療に使用することはできません。

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特徴

低濃度のmiRNAを検出するための優れた感度と特異性
すべてのmiRNAに利用可能な設計済みプローブ
ラベルの幅広い選択肢により、多色検出が可能
標準化されたプロトコールが自動化された高スループットISHに最適
迅速かつ簡単なmiRNA ISHプロトコール

製品詳細

miRCURY LNA miRNA Detection Probesは、高い配列特異性、低い二次構造および最小限のセルフアニーリングをするように　LNAを最適な位置に配置されています。その結果、優れた結合親和性は、miRNAを高いSN比で特異的かつ敏感に検出することができます。

研究プロジェクトでのお見積り、または弊社専門チームとのプロジェクトについて、ご希望がありましたら、 こちら　よりお気軽にご相談ください。

パフォーマンス

ISHおよびノーザンブロッティングにおける優れた感度および特異性

miRCURY LNA miRNA Detection Probesは、高い配列特異性、二次構造およびセルフアニーリングの最小化を達成するためにLNAを最適な位置に設計されています。それにより、優れた結合親和性とmiRNAの特異的かつ高感度なmiRNAの検出を両立しました。プローブがターゲットにする二本鎖の融解温度（T_m値）を84℃近傍に標準化し、一般的には通常82〜86℃の範囲で設定することで、自動解析をサポートする優れたプロトコールを可能にします。

ゼブラフィッシュおよびニワトリ胚で特異的なmiRNA発現パターンを示すことにより、ISH実験におけるこれらのプローブの優れた性能を実証しました（および参照）。

Non-RIでのノーザンブロットでmiRNAを検出する場合、DIGまたはフルオレセインの二重標識プローブ（3'および5'）の使用を推奨します。 miRCURY LNA miRNA Detection Probesは、非常に高い結合親和性、単一ヌクレオチド識別性、顕著なシグナル対ノイズ比を提供し、ノーザンブロッティングによる高度に特異的かつ高感度なmiRNA検出をもたらします。プローブの高い特異性および感度は、ノーザンブロットサンプル量を従来の1/10に低減することも可能です。さらに、露光時間も数時間に短縮することができます（参照）。 miRCURY LNA miRNA Detection Probesは、1か所のミスマッチの識別を可能にします（参照）。

より高いシグナルのための二重標識プローブ

DIGまたはフルオレセインを有する二重標識プローブは、一重標識プローブよりも実質的に高い感度を提供し、利用可能な最も感度の高い検出プローブです。2つのラベルは協調効果をもたらし、S/N比を最大10倍まで高めることができるため、低濃度のmiRNAであっても確実に検出することができます（参照）。最適な結果を得るために、ダブルDIGまたはダブルフルオレセイン標識をお勧めします。ダブルFAMの感度は、ほとんどの場合ダブルDIGの感度と一致します（参照）。

様々なハプテンを使用してFISHや発色ISHの異なる組み合わせで標的miRNAの視覚化が可能になります。miRNA ISHとタンパク質免疫組織化学（IHC）を組み合わせた二重染色は、二重FAMプローブと発色二次抗体の組み合わせに非常に適しています（および参照）。

結果検証のためのコントロールプローブ

miRCURY LNA miRNA Detection Control Probesは、ISHやノーザンブロッティング用のmiRCURY LNA Detection Probesとともに使用するように設計されています。コントロールプローブは長さおよびLNA設計が検出プローブと類似しており、同じT_m 範囲内で設計されています。 U6 snRNA陽性コントロールとスクランブル陰性コントロールは、ISH実験の最適化およびトラブルシューティング中に使用することができますので、これらのコントロールで実験結果を検証ができます（ Detection of hsa-miR-127 and hsa-miR-154参照）。

図参照

miRNA detection in zebrafish.

miRNA detection in chick.

LNA probes are superior to DNA probes when it comes to detecting miRNAs.

LNA probes readily discriminate between single nucleotide differences.

Comparison of double and single DIG labeling.

In situ hybridization using double DIG- and double fluorescein (FAM)-labeled LNA probes in FFPE samples.

Dual stain in ductal carcinoma in situ (DCIS) by ISH and immunohistochemistry (IHC) in a double-fluorescence assay.

Dual stain in normal mammary gland by ISH and immunohistochemistry (IHC) in a double-fluorescence assay.

Detection of hsa-miR-127 and hsa-miR-154 by fluorescent in situ hybridization using miRCURY LNA detection probes in cryopreserved bone marrow cells from an acute myeloid leukemia patient.

原理

カバレッジ

設計済みのmiRCURY LNA miRNA Detection Probesは、miRBaseを参照して設計され、ほとんどの既知無脊椎動物、脊椎動物および植物miRNAに利用できます。またin situ hybridization（ISH）およびノーザンブロッティングに使用するのに適しています。プローブは、3 '、5' または両端（3 'および5'）にDIG、ビオチンおよびフルオレセイン（FAM）など標識をすることが出来ます。またカスタムラベリング用のReady-to-Labelプローブも利用できます。miRNAターゲットにあらかじめ設計されたプローブが利用できない場合、または別のラベルが必要な場合は、カスタムmiRCURY LNA miRNA Detection Probesで対応が可能です。

1日でのmiRNA ISH プロトコール

1日でのmiRNA ISHプロトコールは、FFPE組織切片中のmiRNAの検出用に設計されています。このプロトコールは、非哺乳動物ハプテンジゴキシゲニン（DIG）またはフルオレセインを使用し、1日で終わるように最適化されています。まず、miRNAはProteinase Kを用いて露出させ、二重DIGまたは二重フルオレセイン標識LNAプローブをmiRNA配列に結合させます。DIGまたはフルオレセインハプテンは、アルカリホスファターゼ（AP）に直接コンジュゲートしている特異的抗DIGまたは抗フルオレセイン抗体によってそれぞれ認識されます。APは、可溶性基質である4－ニトロブルーテトラゾリウム（NBT）および5－ブロモ-4－クロロ-3'－インドリルホスフェート（BCIP）によって暗青色の沈殿物に生成させます。より良い組織学的観察を明瞭化するため、切片の核をカウンター染色することをおすすめします。

免疫組織化学および病理学研究室等でのアプリケーション

miRCURY LNA miRNA Detection Probesは、バイオバンク保管材料などの凍結およびホルマリン固定パラフィン包埋（FFPE）組織から、全マウント、単一細胞および切片を含む、様々な組織および細胞調製物において有用です。したがって、これらのプローブは、FFPEサンプルの日常的なISH分析に使用することができます。プローブは、発色または蛍光検出の両方を使用する様々なISHプロトコールと互換性があります。さらに、弊社のISHプロトコールをIHCと共に使用して二重染色を行うことができます。

miRCURY LNA miRNA Detection ProbesでのLNA技術は、プローブの親和性を高め、T_mを揃えられるために、すべてのプローブが同じ条件下で最適に機能します。これにより、非常に堅牢なプロトコールの標準化が容易になり、プローブは自動ISHプロトコルでの使用にも最適なツールになります。さらに、S/N比が高いため、自動画像解析も容易になります。

FFPR ISHの推奨

FFPE組織切片でのmiRNA ISH実験については、miRNA ISHのOne-dayプロトコールを推奨します。二重標識プローブをご使用の場合は、キットハンドブックをご参照ください。このプロトコールは、miRCURY LNA miRNA Detection Probesを使用するために最適化されており、IHC染色プロトコールより工程が少なく、迅速な操作手順になっています。miRCURY LNA miRNA ISH Buffer Set（FFPE）は、miRCURY LNA miRNA Detection Probes用に開発されています。

操作手順

プロトコールは時間のかかる最適化工程を最小限に抑え、DIG標識プローブ用の比色法で、迅速かつ最適なmiRNA ISH分析を可能にします。組織切片、miRNA特異的陽性および陰性コントロールプローブの選択、インキュベーション時間および温度、miRCURY LNA miRNA検出プローブ濃度および基質インキュベーションを含む手順の各ステップが詳細に記載されています。詳細については、キットハンドブックをご参照ください。

アプリケーション

miRCURY LNA miRNA Detection Probesは、細胞内および細胞内miRNA局在やmiRNA発現量の測定など、多数のアプリケーションでの使用が可能です。この手順の堅牢性は、個々のmiRNAのハイスループットISH解析やローカリゼーション研究の優れたツールになります。

裏付けデータと数値

Detection of hsa-miR-127 and hsa-miR-154 by fluorescent in situ hybridization using miRCURY LNA detection probes in cryopreserved bone marrow cells from an acute myeloid leukemia patient.

Panels A and B show the cytoplasmic detection of miR-127 and miR-154, respectively. Panel C shows the nuclear expression of the positive control U6 small RNA as visualized using the miRCURY LNA U6 control probe. No signal was detected when cells were hybridized with the miRCURY LNA scramble probe as a negative control, as seen in panel D. Data used with kind permission from Dr. Silvana Debernardi, Institute of Cancer, London, UK. Original figure appears in Dixon-McIver A, East P, Mein CA, Cazier J-B, Molloy G, et al. (2008) Distinctive Patterns of miRNA Expression Associated with Karyotype in Acute Myeloid Leukaemia. PLoS ONE 3(5): e2141. doi:10.1371/journal.pone.0002141.