PyroMark PCR Kit

• 様々なサンプルからゲノムDNAおよびBisulfite変換DNAを高い特異性で増幅
• パイロシークエンス解析用に至適化済みのキット
• 至適化不要で高収量のPCR産物
• 室温でセットアップできる簡便なマスターミックス
• 至適化済みのプロトコール

PyroMark PCR Kitはパイロシークエンス解析用に特別に至適化され、DNAテンプレートを変異検出、SNP検出、メチル化解析、シークエンシングなど様々なアプリケーション用に高い特異性で均一に増幅します。本キットは、特異性の高い増幅用に至適化済みのPyroMark Reaction BufferとHotStarTaq DNA Polymeraseからなる簡便なマスターミックスフォーマットでお届けします。さらに増幅困難なテンプレート（GCリッチなど）用に最適なQ-Solutionも入っています。PyroMark PCR KitにはまたCoralLoad Concentrateが同梱されており、パイロシークエンス解析において信頼できる結果が得られます。CoralLoad Concentrateには2種類のマーカー色素が入っているので、パイロシークエンス解析を行なう前にPCR産物をすぐにゲルにロードしチェックできます。

PyroMark PCR Master Mix

PyroMark PCR Kitは、パイロシークエンス解析に最適なDNAテンプレートのPCR増幅を可能にします。全てのPCRサイクルのアニーリングステップ中、画期的なバッファー成分により、特異的なプライマー結合の比率が非特異的な結合に比べて高くなります。ゲノムDNAをBisulfite処理すると、非メチル化シトシンはウラシルに変換され、主に3種類の塩基で構成されるDNAがつくられます。このPCRバッファーは、KClと(NH₄)₂SO₄のユニークな配合比により、従来のPCRバッファーに比べ幅広いアニーリング温度やMg²⁺濃度の範囲で厳密なプライマーアニーリング条件を実現します。塩をバランスよく配合したPyroMark PCR Kitのユニークなマスターミックスは、特異的なプライマー結合を確実にし、ミスプライミングを防ぎます。この特殊な配合組成は、ビオチン化プライマーの過剰な蓄積も防ぎ、パイロシークエンス反応を妨害する可能性があるアーティファクトの発生を最小限に抑えます。高収量の特異的なPCR産物が得られることで、パイロシークエンス法の結果が信頼できるものになります。 

各PCRサイクルのアニーリングステップの間、このバッファー組成により、プライマーの非特異的結合に対する特異的結合の比が高くなります（図 " プライマーのアニーリングにおける特異性が増加"）。本製品のPCRバッファーは、独自のバランスでKClと(NH₄)₂SO₄を含んでおり、従来のPCRバッファーと比べて幅広い範囲のアニーリング温度とMg²⁺ 濃度条件で、厳密なプライマーアニーリングが可能になります。アニーリング温度やMg²⁺ 濃度を変化させてのPCR最適化実験は、通常は必要ありません。

HotStarTaq DNA Polymerase

マスターミックス中のHotStarTaq DNA Polymeraseは、QIAGENの組み換えTaq DNA Polymerase（94 kDa）を改良しています。HotStarTaq DNA Polymeraseは、常温では不活性状態でポリメラーゼ活性はありません。この特性により低温でのミスプライムによる増幅産物やプライマーダイマーの形成を抑制できます。HotStarTaq DNA Polymerase は、95 ℃、15分間のインキュベーションステップで活性化され、このステップは既存のサーマルサイクリングのプログラムに容易に導入できます。HotStarTaq DNA PolymeraseはPCRの特異性を高め、特異性の高いPCR産物の収量が増加します。全ての反応成分は室温で混和できるのでPCRセットアップが迅速かつ簡単に行なえます。

Q-Solution

PyroMark PCR Master Mixには画期的なPCR添加剤であるQ-Solutionが添付されており、DNAの変性環境を改善することで、増幅困難なテンプレートの増幅を可能にします。このユニークな試薬により、高度な二次構造を持つテンプレートやGCリッチなテンプレートなどの増幅反応を促進します。DMSOのような汎用されているPCR添加物と異なり、Q-Solutionはどのようなプライマーテンプレートでも一定の濃度で作用し、毒性もなく、PCR純度は保証されています。Q-Solution存在下で増幅したPCRフラグメントはパイロシークエンスで良好な結果が得られます。

CoralLoad Concentrate

2種類のマーカー色素とゲルローディング試薬が入った CoralLoad Concentrateがキットに添付されています（図 " CoralLoad Concentrate"）。CoralLoad Concentrateを用いた際は、PCR産物を直接アガロースゲルにロードでき、ゲルローディングバッファーおよびマーカー色素を前もって添加する必要がありません。CoralLoad ConcentrateをPCRに添加しても、増幅感度や特異性に影響しません。CoralLoad Concentrate存在下で増幅したPCRフラグメントはパイロシークエンスで良好な結果が得られます。

PyroMark PCR Kit は、パイロシークエンス解析用に至適化されたDNAテンプレートのPCR増幅を実現します。テンプレートDNAを便利なPyroMark PCR Mastermix、Q-Solution、CoralLoad concentrate、および増幅プライマー（一方はビオチン化されているもの）と混合します。HotStarTaq DNA Polymerase は室温では不活化されているため、氷上で反応セットアップを行なう必要はありません。