QIAseq miRNA Library Kit

次世代シークエンシングを用いた差次的発現解析と新規遺伝子発見のためのゲルフリー miRNA Sample to Insightソリューション

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QIAseq miRNA Library Kit (12)

Cat. No. / ID: 331502

For 12 sequencing prep reactions: 3’ ligation, 5’ ligation, reverse-transcription, cDNA cleanup, library amplification and library cleanup reagents; quality control primers

KitIndex

Library Kit

miRNA Index Kit Version 1

miRNA Index Kit UDI Version 2

Reactions

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QIAseq miRNA Library Kitは分子生物学的アプリケーション用であり、疾病の診断、予防、あるいは治療に使用することはできません。

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特徴

わずか1 ngの全RNAからゲルフリーmiRNAシーケンシングライブラリー調製
アダプターダイマーおよび不要RNA種の除去による、最高のフィデリティと高効率データ
ビーズベースでのアダプターダイマーおよび不要RNA種除去
個々のmiRNA分子の定量を可能にするIntegrated Unique Molecular Indices（UMI）
GeneGlobe Data Analysis Centerを使用した一次リードマッピングおよび差次的発現解析

製品詳細

最適化された反応は、反応バイアスを最小限に抑え、アダプターダイマーを排除しながら、確実なmiRNA特異的ライブラリー調製を可能にします。 Unique Molecular Indices（UMI）は反応初期段階で各miRNAをタグ付けし、PCRおよびシーケンシングバイアスを排除します。 GeneGlobeを介した無料の統合されたデータ解析により、miRNAマッピングとUMI解析、および差次的発現解析が可能です。

パフォーマンス

QIAseq miRNAシークエンシングにより、改善されたワークフローにより優れたデータ生成が可能です。標準的なQIAseq miRNA法は、ゲル精製・切り出しおよび溶出を必要とせず、サンプル損失を防ぎ、処理時間を短縮します。

miRNAシーケンシングの大きな問題は、アダプターダイマーの混入があることです。 QIAseq miRNA Library Kitは完全に最適化されたライブラリープロセスを採用し、非常に低いtotal RNA量でもアダプターダイマーを実質的に排除します（を参照）。さらに反応は、確実なmiRNA作製に焦点を絞り、バイアスとバックグラウンドの混入を排除します。これらの利点により、QIAseq miRNA Library Kitは、シーケンスに利用可能なmiRNAの収量を最大化することができます。

QIAseq miRNA Library Kitは、潜在的なバイオマーカーとしての循環型miRNAに対応するために、低入力レベルにまでmiRNAをマッピングできるように最適化されています。さらに、逆転写プロセス中にUnique Molecular Indices（UMI）を導入し、NGSによる成熟miRNAの不均一かつ正確なmiRNome全体定量を可能にします。 QIAseq miRNAは、次世代シークエンシングを使用して、差次的発現解析と新規miRNA発見のための比類のないSample to Insightソリューションを提供します（を参照）。

図参照

Adapter dimers (AD) and contaminating RNAs steal your reads during miRNA sequencing experiments

QIAseq miRNA workflow

原理

成熟miRNAは、転写後遺伝子調節を仲介する、天然の22ヌクレオチドのnon-coding RNAです。 miRNAの改変は、発生、分化、シグナル伝達、感染、老化および疾患における遺伝子発現の変化と相関します。血清、血漿、脳脊髄液（CSF）および尿を含むすべての生体液中で発現されるmiRNAとして、循環miRNAと正常および疾患生物学を関連付ける証拠が継続的に報告されています。特に癌においては、多くの研究とレビューが、様々なmiRNAの存在と癌細胞増殖、アポトーシスに対する抵抗性、侵襲性および分化を関連づけています。

miRNA発現の定量は、次世代シークエンシング（NGS）およびリアルタイムPCR（qPCR）を含む様々な技術で行うことができます。 NGSは新規miRNA発見のためのデフォルトツールですが、市販のライブラリー調製キットは煩雑でバイアスを導入します。結果として、これまでmiRNA発現定量にはqPCRが用いられていました。 QIAseq miRNAは、新世代のsmall RNAシークエンシング製品で、他のシーケンシングキットにはない特長を含んでいます。 QIAseq miRNA Library Kitを使用することで、UMIによる単一分子の定量とNGSの能力を組み合わせて、最も代表的な発現データを得ることができるようになりました。

操作手順

QIAGENは、試料分離からデータ分析および解釈まで、真のSample to Insightワークフローを提供します。 miRNeasyキットを使用して、生体液（血清、血漿、CSFおよび尿など）、細胞、新鮮/凍結組織またはFFPE組織から全RNAを最初に抽出します。そこから、QIAseq miRNA Library Kitを使用してmiRNAシークエンシングライブラリーを調製します（図を参照）。

バイアスの無い反応では、アダプターをmiRNAの3 '末端および5'末端に連続して結合します。続いて、UMIを導入したcDNA合成、cDNAクリーンアップ、ライブラリー増幅およびライブラリークリーンアップが行われます。独自の方法により、修飾オリゴヌクレオチドを用いて、シークエンシングライブラリー中のアダプターダイマーを排除し、シークエンシング時に観察される主要な汚染物質を効果的に除去します。ビーズベースのクリーンアップは、不要なバックグラウンドノイズを排除します。 UMIは、増幅またはシークエンシングアーティファクトではなく、サンプルが特異的にされていることを保証します。サンプルからシーケンサーに移るまでに、わずか8時間しかかかりません。最大48サンプルをマルチプレックス化することができます。

シーケンシングの後、 ".fastq"または ".fastq.gz"ファイルをGeneGlobe Data Analysis Centerに直接アップロードして、一次マッピングと分子タグカウントを行うことができます。ヒト、マウス、ラットなどのよく特徴付けられた種については、種特異的miRBaseおよびゲノムデータベースにマップされます。特徴づけられていない種または新規種については、miRBaseデータベース全体にマッピングされます。次いで、分子タグ数計測および得られたデータの視覚化をとおして差次的発現解析を行います。

アプリケーション

QIAseq miRNA Library Kitは、total RNAおよびmiRNAを含む、血清、血漿、CSF、尿などの生体液、細胞、新鮮/凍結組織、FFPE組織に適合しています。 QIAseq miRNAを使用して、次の循環miRNAバイオマーカーを特性化することができます。 FFPE組織に閉じ込められたmiRNAシグネチャーを明らかにすることができます。新しい種を完全に特性化することができます。 QIAseq miRNA Library Kitは、血清などの生体液からの収量を高めるように設計されています。 miRNA検出の図では、QIAseq miRNA Library Kitによる血清サンプルからのmiRNAの確実な検出を示しています。次いで、マッピングされたリードを、血清サンプル中のアダプターダイマーと比較しました。 QIAseq miRNAは、限られたサンプルでもmiRNAの優れたマッピングを示しています（を参照）。 QIAseq miRNA Library Kitを使用して、任意の種由来の全RNAサンプルから、既知または新規のmiRNAの差次的な発現を決定することができます。

QIAseq miRNAは、数百サンプルを処理する大規模プロジェクトから、標的miRNAのグループに焦点を当てた小さなパイロットまで、発見と発現を強化する究極のツールです。 QIAseq miRNAは、次世代シークエンシングを用いた差次的発現解析と新規miRNAの発見のための比類のないSample to Insightソリューションを提供します。

図参照

Read distribution in serum samples

裏付けデータと数値

Adapter dimers (AD) and contaminating RNAs steal your reads during miRNA sequencing experiments

While gels can be used to eliminate adapter dimers and contaminating RNAs, there is still a possibility for high prevalence in sequencing reads even after gel excision. On the above left, QIAseq miRNA shows a robust miRNA library with no adapter dimers or contaminating RNA after the basic protocol that includes a bead-based purification. Compared to libraries generated with competitor kits (prior to a required tedious gel excision), the QIAseq-derived miRNA library is much more robust and devoid of adapter dimers and contaminating RNAs.

リソース

For use with QIAseq miRNA library kits (331502, 331505) and QIAseq miRNA Index Kits UDI (331601, 331615, 331625, 331635, 331645, 331655, 331665, 331675, 331685, 331905, 331915, 331895, 331925, 331935, 331945, 331955, 331965, 331977, 331987, 331998)

For use with QIAseq miRNA library kits (331502, 331505) and Singular Genomics UDI Primer kit

For use with QIAseq miRNA library kits (331502, 331505) and QIAseq miRNA Index TF Kits (331582, 331585)

For use with QIAseq miRNA Library Auto Kit (384) (331509) and QIAseq miRNA 96 Index IL Auto A (331567, 331569)

For use with QIAseq miRNA library kits (331502, 331505) and QIAseq miRNA Index IL Kits (331592, 331595, 331565)

Poster for download

Download Safety Data Sheets for QIAGEN product components.

Publications

Multisite Evaluation of Next-Generation Methods for Small RNA Quantification.

Herbert ZT; Thimmapuram J; Xie S; Kershner JP; Kolling FW; Ringelberg CS; LeClerc A; Alekseyev YO; Fan J; Podnar JW; Stevenson HS; Sommerville G; Gupta S; Berkeley M; Koeman J; Perera A; Scott AR; Grenier JK; Malik J; Ashton JM; Pivarski KL; Wang X; Kuffel G; Mesa TE; Smith AT; Shen J; Takata Y; Volkert TL; Love JA; Zhang Y; Wang J; Xuei X; Adams M; Levine SS;

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FAQ

When using the QIAseq miRNA Library Kit in combination with QIAseq miRNA NGS 12 Index IL (cat. no. 331592), QIAseq miRNA NGS 48 Index IL (cat. no. 331595), or QIAseq miRNA NGS 96 Index IL (cat. no. 331565), the recommended protocol suggests a 75 bp single read. “FASTQ Only” should be selected, with “TruSeq Small RNA” chosen from the Sample Prep Kit dropdown menu.

When using the QIAseq miRNA Library Kit in combination with any of the QIAseq miRNA UDI kits: QIAseq miRNA 12 Index Kit IL UDI (cat. no. 331601), or QIAseq miRNA 96 Index Kit IL UDI (cat. no. 331615, 331625, 331635, 331645, 331655, 331665, 331675, 331685, 331717, 331727, or 331738), the recommended protocol suggests a 72 bp single read. “FASTQ Only” should be selected, with “TruSeq Small RNA” chosen from the Sample Prep Kit dropdown menu.

FAQ ID - 3668

No, this is not advised. The miRCURY LNA products should be used for dPCR or qPCR analysis of miRNAs.

FAQ ID - 3674

Total RNA from cells, fresh/frozen tissue, FFPE tissue, serum/plasma, bloods and other fluids are compatible with the QIAseq miRNA Library Kit.

FAQ ID - 3660

Proprietary technology utilizing modified oligonucleotides is used to eliminate the reverse-transcription of adapter dimers.

FAQ ID - 3667

No. The components of the QIAseq miRNA Library Kit are not interchangeable with components from any other QIAGEN kits

FAQ ID - 3662

Total RNA containing miRNA is the required starting material for the QIAseq miRNA Library Kit. It is not necessary to enrich for small RNA. If, however, it is desired to work with small RNA samples, small RNA represents approximately 10% of total RNA amounts. Therefore, as an example, 100 ng of total RNA translates to 10 ng small RNA; as a result, you would use the adapter and RT primer dilutions recommended for 100 ng total RNA (when working with 10 ng small RNA).

FAQ ID - 3659

When inputting the adapter sequence for adapter trimming, the following DNA sequence should be used:

(5’–3') GTTCAGAGTTCTACAGTCCGACGATC

FAQ ID - 3672

No, these are not compatible. A UDI-specific 5’ adapter (UDI 5’ Adapter) and UDI-specific RT Initiator (UDI RT Initiator) are included in each QIAseq miRNA UDI kit.

FAQ ID - 3836

With single, 6 bp indexes, the maximum number is 48. With single, 8 bp indexes, the maximum number is 96. With unique dual indexing, the maximum number is 768.

FAQ ID - 3665

The miRCURY LNA products should be used for dPCR or qPCR analysis of miRNAs.

FAQ ID - 3675

It is recommended to allocate 5–10 million reads per sample.

FAQ ID - 3673

During the QIAseq miRNA Library Kit library construction process, each individual miRNA molecule is tagged with a UMI. Following sequencing, raw reads are mapped to individual miRNA molecules instead of just individual miRNAs. This allows for true quantification of the miRNAs by eliminating any library amplification and sequencing bias.

FAQ ID - 3669

If the workflow is not expected to be completed in one day, convenient stopping points are indicated at various points in the handbook including after “cDNA cleanup” and after “library amplification cleanup”. Additionally, the libraries can be left overnight on a thermal cycler during library amplification.

FAQ ID - 3663

No, the QIAseq miRNA Library Kit is designed to minimize the presence of hY4 Y RNA in the sequencing library

FAQ ID - 3670

Yes. If Library QC suggests that the library is of good quality and simply low in concentration, it can still be used for sequencing. It is possible to either sequence the library at 2nM or otherwise at the maximum amount available for that library (either individually or in multiplex with other samples). It is recommended to keep all libraries being multiplexed at comparable concentrations

FAQ ID - 3666

Please refer to the Illumina^® TruSeq^® Library Prep Pooling Guide available through http://support.illumina.com.

FAQ ID - 3664

When using single indexes, pure miRNA libraries are approximately 180 bp, and pure dimer libraries are approximately 157 bp. If there is a peak at approximately 165–173 bp, this comprises "RNA fragments or other small RNAs that aren't miRNAs"; these are common to see in total RNA samples, being particularly strong in biofluid total RNA samples. Even if a peak is observed at 175–173 bp, there is still likely miRNAs present in the sample. Any RNA that has a 3’ OH and 5’ PO4, and is approximately 50 bp and smaller, should be robustly captured by the QIAseq miRNA Library Kit.

When using the miRNA UDI indexes, pure miRNA libraries are approximately 200 bp, and pure dimer libraries are approximately 177 bp. If there is a peak at approximately 185–193 bp, this comprises "RNA fragments or other small RNAs that aren't miRNAs"; these are common to see in total RNA samples, being particularly strong in biofluid total RNA samples. Even if a peak is observed at 185–193 bp, there is still likely miRNAs present in the sample. Any RNA that has a 3’ OH and 5’ PO4, and is approximately 50 bp and smaller, should be robustly captured by the QIAseq miRNA Library Kit.

FAQ ID - 3837

Heparin is a potent reverse-transcription inhibitor. After total RNA isolation from heparinized plasma samples, the heparin must be removed. One option is to treat the total RNA samples with heparinase prior to library construction with the QIAseq miRNA Library Kit.

FAQ ID - 3661

(5’-3’) AACTGTAGGCACCATCAAT

FAQ ID - 3671

(5’–3') CTACACGACGCTCTTCCGATCT

FAQ ID - 3835