miRCURY LNA miRNA PCR Assays

• 타의 추종을 불허하는 민감도로 총RNA 단 1pg에서 miRNA 정량화가 가능함
• 혈청/혈장, FFPE 절편, LCM 샘플 등 RNA 수율이 낮은 샘플에 적합함
• 높은 특이성으로 전구체(precursors)에서 밀접하게 관련된 miRNA 및 mature miRNA를 구별함
• 빠르고 간단한 2단계 프로토콜로 3시간 미만이 소요됨
• 전체 miRBase 적용 범위를 통해 모든 유기체의 miRNA 프로파일링이 가능함

miRCURY LNA miRNA PCR Assays는 개별 miRNA PCR 프라이머 세트로, miRCURY LNA miRNA PCR System을 통해 매우 민감하고 특이적인 miRNA 정량화를 실현합니다. 정방향 및 역방향 PCR 증폭 프라이머 모두 miRNA 특이적이며 LNA 기술로 최적화되어 있습니다. 분석은 튜브나 튜브 또는 웰당 200 reaction이 가능한 플레이트를 통해 제공됩니다.

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탁월한 민감도

miRCURY LNA miRNA PCR Assays의 탁월한 민감도는 범용 역전사를 LNA 강화 및 T_m 정규화 프라이머와 결합함으로써 얻은 것입니다. 이 조합은 최초 가닥 cDNA 합성에서 총RNA 1pg만을 투입하여 개별 miRNA를 정확하고 안정적으로 정량화할 수 있도록 합니다(그림  총RNA 시재료 1pg부터 정확한 정량화 가능 참조).
LNA 강화 프라이머는 (특히 AT가 풍부한 miRNA에 대해) 스템 루프 또는 표준 DNA 프라이머를 사용하는 기타 miRNA real-time PCR 시스템에 비해 훨씬 나은 민감도를 제공합니다(그림  DNA 프라이머에 비해 민감도가 크게 향상된 LNA 강화 프라이머 참조).
또한 샘플 요구량이 적으므로 LCM 샘플 및 혈청/혈장과 같은 어려운 샘플의 정제된 총RNA를 사용하여 miRNA를 정량화할 수 있습니다(그림  FFPE 조직 절편에서 LCM 표본의 miRNA 차등 발현 검출 및  혈청 샘플 간 miRNA 발현 차이 참조).

완벽한 검증 및 최적화 완료

모든 웨트 랩(wet-lab) 검증 miRCURY LNA miRNA PCR Assays는 최대한 민감도를 높이도록 최적화되었습니다. 분석의 80% 이상이 PCR 반응에서 miRNA 복사본을 5개 이상 감지합니다(그림  hsa-miR-181a의 연속 희석 참조). 또한 프라이머 세트는 표적의 특이적 증폭 및 최소 배경 신호에 대해 검증되었습니다(그림  miRNA의 특이적이고 민감한 증폭 참조).

완벽한 특이성을 갖춘 유일한 플랫폼

miRCURY LNA miRNA PCR Assays는 절대 특이성을 갖춘 유일한 miRNA 정량화 플랫폼이며(Nature Methods에 게재된 miRQC 연구 참조) 특이성 테스트에서 다른 프로브 기반 miRNA qPCR 플랫폼보다 뛰어난 성능을 보였습니다(그림 프로브 기반 miRNA qPCR 시스템을 사용한 특이성 테스트 참조). 또한 이는 완벽한 특이성으로 인해 위양성이 발생하지 않으며 miRNA 신호가 강력하고 안정적입니다.

우월한 식별성

정방향 및 역방향 PCR 증폭 프라이머 모두에 LNA를 통합하면 단 하나의 뉴클레오티드만으로 다른 miRNA 서열을 구별할 수 있는 분석을 설계할 수 있습니다(그림  단일 뉴클레오티드 구별 참조). 또한 분석은 mature miRNA 서열과 전구체 miRNA를 구별할 수 있습니다.

쉽고 빠르며 재현 가능

쉽게 따라할 수 있는 3시간 프로토콜을 통해 실험실에서 시간과 노력을 절약할 수 있습니다. 모든 후속 PCR 반응에서 동일한 RT 반응을 템플릿으로 사용하므로 miRNA 특이적인 최초 가닥 합성이 필요한 시스템에 비해 절차가 크게 간소화됩니다. 피펫팅 단계의 수가 최소한으로 줄어들고 기술적 변동이 최소화됩니다. 이로 인해 일별 및 현장 간에 매우 높은 재현성을 달성할 수 있습니다.

miRCURY LNA miRNA PCR Assays는 miRCURY LNA RT Kit 및 miRCURY LNA SYBR Green PCR Kit와 함께 사용하도록 최적화되었습니다. 다른 시약을 사용하면 결과 품질에 영향이 갑니다.

miRNA 프로파일링을 위한 고유한 시스템

miRCURY LNA miRNA PCR Assays는 범용 RT와 LNA PCR 증폭을 결합하여 microRNA real-time PCR 시장에서 최고의 성능과 사용 편의성을 제공합니다(그림  miRCURY LNA miRNA PCR System 개략도 참조). 범용 RT를 사용하면 하나의 first-strand cDNA 합성 반응을 여러 miRNA real-time PCR 분석을 위한 템플릿으로 사용할 수 있습니다. 이는 귀중한 샘플을 절약하고 기술적 변동을 줄이며 실험실에서 시간을 절약합니다. 또한 정방향 및 역방향 PCR 증폭 프라이머는 miRNA 특이적이며 LNA로 최적화되어 있습니다. 이는 1) 매우 낮은 miRNA 수준의 정확한 정량화를 가능하게 하는 탁월한 민감도와 매우 낮은 배경 및 2) 밀접하게 관련된 miRNA 서열을 구별할 수 있는 매우 특이적인 분석을 제공합니다.

적용 범위

miRBase 20의 모든 유기체에 대해 20,000개 이상의 분석 항목을 사용할 수 있습니다. 1,400개 이상의 분석 항목이 합성 및 다양한 생물학적 샘플 모두에 대한 민감도, 특이성, 효율성 및 배경에 대해 충분한 웨트 랩(wet-lab) 검증을 거쳤습니다. 나머지 분석은 각 유기체 내에서 최적의 민감도와 특이성을 가진 고품질의 종 특이적 LNA 강화 분석을 보장하는 포괄적인 설계 알고리즘을 사용한 인실리코(in silico) 검증을 거쳤습니다. 이는 서로 다른 여러 분석 항목이 동일한 서열을 표적으로 할 수 있음을 의미합니다. 궁극적으로 각 종에 대한 분석은 유기체의 유전적 배경에 따라 선택됩니다. NGS 실험과 같은 새로운 miRNA 실험을 하는 경우 모든 miRNA에 대해 LNA miRNA 프라이머 세트를 맞춤 제작으로 이용할 수 있습니다.

정규화(normalization)를 위한 참조 유전자 분석

9개의 참조 유전자 프라이머 세트를 사용할 수 있어 다양한 샘플 유형에서 고품질 데이터 정규화 및 신뢰할 수 있는 데이터 생성이 가능합니다(아래 표 참조). 이러한 대조물질 프라이머 세트는 다양한 인간 조직에 걸쳐 구성적으로 그리고 상대적으로 안정적으로 발현되는 내인성의 작은 non-coding RNA를 표적으로 합니다(그림  다양한 인간 조직에서 참조 유전자의 발현 수준 참조). 대조물질 참조 유전자는 광범위한 C_q 값을 다루며 다양한 miRNA 발현 정도를 정확하고 안정적으로 정규화할 수 있도록 합니다.
대조물질 프라이머 세트는 miRCURY LNA miRNA PCR System의 참조 유전자로 검증되었으며 miRCURY LNA RT Kit 및 miRCURY LNA SYBR Green PCR Kits와 함께 사용할 경우 최적으로 작동합니다. 참조로 선택하기 전에 항상 모든 조직과 특정 실험의 모든 처리에서 유전자가 일관되고 변함 없이 발현되는지 확인하는 것이 매우 중요합니다. 여러 참조 유전자를 테스트하고 GeNorm 및 NormFinder(GenEx 소프트웨어의 일부)와 같은 소프트웨어를 사용하여 참조 유전자를 선택하고 검증하는 것이 좋습니다.
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• Mature miRNA 정량화
• snoRNA 감지