GeneRead DNA FFPE Kit

GeneRead DNA FFPE Kit采用基于硅胶模离心柱的优化实验方案，能够从福尔马林固定、石蜡包埋（FFPE）组织样本中纯化出高品质基因组DNA。由于胞嘧啶的脱氨作用所导致的C>T人为突变现象在二代测序技术中影响很大。此类人为突变由福尔马林固定以及样本老化所引发，会导致测序结果产生偏差。GeneRead FFPE纯化步骤中引入了酶促处理，能够消除此类人为突变，从而保证了基因组DNA的产量高、纯度好，特别适用于二代测序应用。

从有限的起始材料中获得高产率

由于文库制备和测序技术的不断进步，对生物样本库内大量的FFPE组织样本实施高通量测序逐渐成为可能，这无疑吸引了研究者的目光。这些测序技术同时也降低了可靠检测测序突变的频度阈值。不过，对FFPE样本进行测序还是存在多种挑战。FFPE样本的DNA产率可能受到DNA损伤的影响。此外，这些样本通常具有不可替代性，因此需要从最少量的起始材料中获取最多的核酸样本量。除了DNA产率的考虑之外，人为突变对FFPE样本测序的影响在起始样本量有限的情况下也会变得更为严重，此时错误突变的频率也会相应增加。相比标准的FFPE DNA分离方案，GeneRead DNA FFPE Kit能够为小样本（1 x 10 μm切片样本）提供更高产量的双链DNA（参见 High yields of double-stranded DNA）。GeneRead DNA FFPE Kit与另一供应商的同类试剂盒相比，可获得高达4倍的双链DNA产率（参见 GeneRead DNA FFPE Kit outperforms a kit from another supplier）。

有效减少人为的C>T|G>A转换

由福尔马林固定和储存所致的DNA损伤主要以随机形式发生，因此序列上的突变位置不同。只有少数基因组拷贝上发生了全局性的破坏，因此这些人为突变的发生频率通常较低。而低频度的新突变可能携带有十分重要的信息（例如在癌症分析中），因此很有必要在低频突变中区分真实突变与人为突变。GeneRead DNA FFPE方案通过考查样本的新低频突变，可对人为突变的数目以及清除效率进行测定。GeneRead DNA FFPE Kit极大降低了低频C>T|G>A转换，同时有效保留了真实突变（参见 Dramatic reduction in artifactual C>T|G>A mutations和 Retention of high-frequency C>T|G>A transitions）。

最大限度减少假阳性突变的风险

在癌症相关的SNP分析过程中，去除C>T|G>A的人为突变显得尤为重要。脱氨作用多为随机发生，如这些人为突变未经有效清除，可能被解释为具有癌症相关性的突变，进而成为假阳性结果。GeneRead DNA FFPE Kit去除人为突变，从而使假阳性风险降至最低。

从FFPE组织为二代测序制备DNA还有几个挑战。由于样品稀缺和DNA可能存在受损状况，DNA产量通常较为有限。此外，从有限材料开始的测序过程，往往存在由于固定和包埋条件以及长期储存而产生的人为突变。这之中的一个特殊问题是，胞嘧啶碱基脱氨变成脱氧尿嘧啶，从而导致在测序反应中出现C-T转变。此现象的确切机制尚未可知，可能的解释是胞嘧啶的脱氨作用导致在该位置产生了尿嘧啶，后者会与腺嘌呤配对。在测序过程中，这一改变随后会按照C>T转换后的结果读取。如果在文库构建过程中链信息未能保留，则两条链都会被测序，这时此人为突变可能显示为C>T或G>A转换。很有必要去除这些人为突变，特别是对于癌症样本的测序分析而言，因为这些干扰在此类样本中会被检测为假阳性。当进行FFPE样本测序时，由于起始原料有限而假阳性基因突变的相对频率增加，避免人为突变至关重要。

GeneRead DNA FFPE Kit提供了一种从少量FFPE组织切片高效纯化高产率DNA的高效流程。此外，该流程包含去除脱氨基胞嘧啶的步骤，可避免DNA测序出现假阳性结果。

在结合QIAamp MinElute柱之前进行脱蜡并对DNA样品的甲醛解交联。加热除去交联后，DNA就可以通过尿嘧啶DNA糖苷酶特异地去除脱氨基胞嘧啶残基。优化的反应混合物提供了适宜的反应条件，使UNG能从FFPE样品的DNA中特异性去除人为导致的尿嘧啶。DNA结合到离心柱之后，经由Buffer AW1、Buffer AW2和乙醇洗去残留的杂质（比如盐）。残留的乙醇可能干扰随后的酶促反应，需另外由离心步骤彻底去除。DNA洗脱后可直接用于二代测序，也可在–20℃下储存。

GeneRead FFPE DNA kit也可在QIAcube全自动核酸纯化仪上自动运行。

GeneRead DNA FFPE Kit可有效减少胞嘧啶脱氨人为突变，从FFPE样品中纯化出可直接供二代测序使用的DNA。