PyroMark Q24 Advanced

PyroMark Q24 Advanced改进了焦磷酸测序技术，可提供比以往更佳的实时测序检测和定量。PyroMark Q24 Advanced采用先进的技术、软件和化学试剂，适用于分析各种类型的序列差异，尤其是CpG或CpN位点的DNA甲基化、复杂突变或用于从头测序应用（如微生物分型）。

较长的焦磷酸测序运行和更高的准确度

PyroMark Q24 Advanced采用了改进的化学试剂和仪器操作算法，大大增加了读取长度和碱基检出功能的准确度，可轻松实现较长的从头测序运行分析。此前，读取长度受到测序反应中的背景峰和较低的光信号的限制。已升级的PyroMark Q24 Advanced化学试剂和算法可降低该背景峰，从而提高读取长度和可靠性。根据待分析序列的不同，只需一次PyroMark Q24 Advanced反应即可获得高度准确的140个或更多碱基的读取长度 （参见 Long de novo sequencing runs）。

任意位置的更先进的甲基化分析

PyroMark Q24 Advanced可在任意序列位置实现改进的长片段序列甲基化定量。以前，远离测序引物的甲基化位点分析是无法确定的，但现在利用更长的读取长度和更高的准确度，可在整个测序运行中实现高度可靠的甲基化定量（参见 Analysis of 16 CpG sites in a long sequence run）。

改进的同聚物测序准确度

DNA甲基化分析中的亚硫酸氢盐转化可导致核苷酸序列中频繁的poly T延伸，以前，由于这些位点的光信号定量的不确定性，在这种T同聚物之后直接进行CpG位点分析面临诸多难题。PyroMark Q24 Advanced具有更高的准确度，可在8个T核苷酸链之后甚至之中实现可靠的CpG甲基化定量（参见 Improved methylation quantification in homopolymers）。

长片段序列的突变分析

PyroMark Q24 Advanced还可利用单个Assay实现可靠的多态性定量。由于单核苷酸多态性（SNP）及其他突变通常不相邻，因此传统的焦磷酸测序化学方法一般需要分析针对每个突变位点的单独的Assay。全新的PyroMark Q24 Advanced化学方法可实现更长片段分析，在一次运行中实现多个突变或SNP的可靠分析（参见 Quantitative mutation analysis in long sequence runs）。

焦磷酸测序技术采用了合成测序原理，可在数分钟内提供序列定量数据。PyroMark Q24 Advanced是一套全集成系统，可提供实时序列信息，具有高准确度和长读取长度，尤其适用于复杂突变、表观遗传学研究、抗性分型和微生物鉴定分析。该系统包括PyroMark Q24仪器（运行固件3.0或更高）、PyroMark Q24 Advanced Software、PyroMark Q24 Advanced Reagents/PyroMark Q24 Advanced CpG Reagents、PyroMark Q24 Vacuum Workstation和PyroMark Control Oligo（参见下表）。此外还提供样本制备解决方案，利用PyroMark Q24 Vacuum Workstation实现单链DNA的制备。 

焦磷酸测序反应步骤：

步骤1：扩增DNA区段，对用作焦磷酸测序模板的DNA链进行生物素化。变性后，分离生物素化的单链PCR扩增片段，并将其与测序引物杂交。将杂交引物和单链模板与DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、荧光素酶和三磷酸腺苷双磷酸酶及底物腺苷-5'-磷酰硫酸（APS）和荧光素一起孵育（参见 Principle of Pyrosequencing — step 1）。

步骤2：将第一个三磷酸脱氧核苷（dNTP）加入反应中。DNA聚合酶催化dNTP加至测序引物上（若其与模板链上的碱基互补）。每次结合均伴有焦磷酸（PPi）释放，并与加入的核苷酸呈等摩尔量（参见 Principle of Pyrosequencing — step 2）。
步骤3：在腺苷-5'-磷酰硫酸（APS）存在的条件下，ATP硫酸化酶可将PPi转化为ATP。ATP促进了荧光素酶介导的荧光素至氧化荧光素的转化，产生的可见光与ATP的量成正比。利用CCD传感器检测荧光素酶催化反应生成的光，在原始数据中呈峰状（Pyrogram）。各个峰的高度（光信号）与加入的核苷酸数成正比（参见 Principle of Pyrosequencing — step 3）。

步骤4：三磷酸腺苷双磷酸酶——一种核苷酸降解酶——可不断降解未结合的核苷酸和ATP。当降解完成后，加入其他核苷酸（参见 Principle of Pyrosequencing — step 4）。

步骤5：顺序加入dNTP。应注意的是，deoxyadenosine alpha-thio triphosphate（dATPαS）可为DNA聚合酶有效利用，而荧光素酶无法识别，因此被用作天然脱氧腺苷三磷酸（dATP）的替代物。随着过程的继续，互补DNA链不断延伸，利用Pyrogram示踪图上的信号峰确定核苷酸序列（参见 Principle of Pyrosequencing — step 5）。

简化工作流程——从样本到结果

通用PyroMark Q24 Advanced无缝整合至表观遗传学和基因分析工作流程，可与QIAGEN先进的样本制备、重亚硫酸盐转化和PCR扩增技术形成互补。高度可靠的仪器可实现CpG或CpN位点及突变的序列检测和甲基化定量。采用简化的工作流程，可以更快速地获得结果。

快速方便的样本制备

从PCR产物到适合测序使用的单链模板——采用PyroMark Q24 Vacuum Workstation可同时制备至多24个样本，仅需不到15分钟。工作站操作简单，实际“操作时间”不到5分钟。

在焦磷酸测序之前，先生成生物素化PCR产物。该生物素化PCR产物可与链霉亲和素包被的Sepharose微珠结合，利用Vacuum Workstation上的Vacuum Tool可捕获微珠，彻底冲洗并变性，生成适用于焦磷酸测序的单链DNA。将上述模板DNA加至包含测序引物的焦磷酸反应板中，引物退火后，将反应板置于PyroMark仪器上。PyroMark Q24 Advanced Reagents或PyroMark Q24 Advanced CpG Reagents包含焦磷酸测序反应所需的酶、核苷酸和底物；参照软件提供的体积，将试剂加至分装装置内，同样置于仪器内供焦磷酸测序使用。

焦磷酸测序在各学科的研究应用中发挥了愈来愈重要的作用。不论是检查病原体中的抗药性的产生、基因表达调控中表观遗传学DNA甲基化的作用、家畜中特定表型的遗传标志物，还是线粒体DNA法医样本中的多态性，PyroMark Q24 Advanced均可提供功能强大且通用的基因和表观遗传学变异分析。此外，由于焦磷酸测序整合了序列检测和定量，提高的分析分辨率可促进新发现的诞生。

 易于使用的PyroMark Q24 Advanced Software

在PC上安装PyroMark Q24 Advanced Software，可对您的结果进行全面分析。该软件包括4种分析模式——AQ、SNP、CpG和SEQ。AQ模式适用于各种突变定量研究，如SNP和InDels。它适用于单变量和多变量位点及双、三和四等位基因突变分析。SNP模式提供了SNP和InDels的基因型分析。CpG模式可实现单一或多个CpG或CpN位点的甲基化分析，并提供了重亚硫酸盐处理的内部对照。SEQ模式适用于未知序列的碱基检出。

PyroMark Q24 Advanced Software使用方便且直观，为运行分析提供了改进的便捷工具。如果在运行过程中出现问题，或者如果系统利用Assay检测出不一致性，则软件可针对各单独孔提供特定的警告信息（参见警告信息和建议）。“警告信息”（Warning Info）按钮可提供其他警告信息及疑难解答建议和防止其在后续Assay中发生的建议。

使用PyroMark Assay Design Software，灵活、简单的设计焦磷酸测序实验

采用PyroMark Assay Design Software 2.0可轻松设计PCR和测序引物进行焦磷酸测序分析。Assay已经过优化，适用于所有PyroMark仪器。