scientist working on a computer
Digitale PCR

Absolute statt relative Quantifizierung

Auswahl zwischen dPCR und qPCR
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Erkunden Sie die Vorteile und finden Sie heraus, ob es für Ihre Forschungsziele passt

Beim Vergleich zwischen dPCR- und qPCR-Technologien ist der entscheidende Unterschied die Präzisionsleistung. Während beide eine hochsensitive und zuverlässige Nukleinsäuredetektion und -quantifizierung bieten, lässt sich der Hauptunterschied zwischen den beiden Technologien am besten anhand einer Analog- vs. Digitalradio-Analogie beschreiben, so Dr. Jim Hugget, Principal Scientist, National Measurement Laboratory. „Bei einem Analogradio muss zunächst das Einstellrad fein abgestimmt werden, um bei möglichst geringen Störungen die gewünschte Station zu erreichen. Trotzdem hängt die Qualität vom Empfang ab und das Signal unterliegt Störungen durch Rauschen. Das entspricht der qPCR. Sie ist zuverlässig, erfordert aber eine Optimierung, um gute Ergebnisse zu erhalten. Selbst dann ist Hintergrundrauschen unvermeidlich. Beim Digitalradio wird einfach die Station aufgerufen und sie ist entweder mit einem klaren Signal verfügbar oder eben nicht. Genauso ist es bei der dPCR, die präzise, binäre Ergebnisse liefert. Sie zählt wortwörtlich die An- oder Abwesenheit von DNA-Molekülen. Die Klarheit der Ergebnisse, kombiniert mit einer geringeren Fehlerrate, sorgt für eine unglaublich hohe Präzision. Die digitale PCR ist sehr gut zur Messung kleinerer quantitativer Unterschiede geeignet.“

INTERVIEW LESEN

Vergleich und Gegenüberstellung: qPCR vs. dPCR

Forscher schätzen die qPCR wegen ihrer Geschwindigkeit, Sensitivität, Spezifität und Benutzerfreundlichkeit. Die Technik ist am nützlichsten zur Durchführung von Genexpressionsanalysen, für den Pathogennachweis und Mikrobiom-Analysen sowie zur Validierung von Mikroarray-Daten. Bei Anwendungen, die eine herausragende Genauigkeit und Sensitivität erfordern, wie der Analyse von Kopienzahlvariationen oder dem Nachweis von Mutationen und SNPs und der Allelunterscheidung, gerät die qPCR jedoch an ihre Grenzen. Bei derartigen Anwendungen ist die dPCR der qPCR überlegen, da sie nicht nur die absolute Kopienzahl bestimmt, sondern auch die Einschränkungen der Nachweisgrenzen überwindet, d. h. sie ist in der Lage, geringfügige Unterschiede in Form von 10 % Präzision und Mutationsraten < 1 % nachzuweisen.

Dank Probenpartitionierung und Endpunkt-Thermocycling ermöglicht die digitale PCR auch eine robuste Quantifizierung, d. h. eine hohe Toleranz gegenüber PCR-Inhibitoren und eine geringere Beeinflussung durch Änderungen der PCR-Effizienz.

ANWENDUNGSHINWEIS HERUNTERLADEN
Real-time PCR/qPCR Digitale PCR
Quantitativ, relativ oder absolut, aber Standardkurven
oder Referenzproben sind erforderlich		 Quantitativ, absolut und keine Standards
oder Referenzen erforderlich

Massen-PCR

  • flexible Reaktionsvolumen
  • beeinflusst durch Änderungen der PCR-Effizienz,
    da die Daten in der exponentiellen Phase erfasst werden
  • anfällig für Inhibitoren

Probenpartitionierung

  • höhere Toleranz gegenüber
    Inhibitoren/gesteigerte Robustheit
  • nicht beeinflusst durch Änderungen
    der Amplifikationseffizienz
  • höhere statistische Aussagekraft
    dank Poisson-Statistik
Misst PCR-Amplifikation in jedem Zyklus Misst nach Abschluss der PCR-Zyklen
Detektiert Mutationsraten > 1 % Detektiert Mutationsraten von ≥ 0,001 % (hohes
Signal-zu-Rauschen-Verhältnis)
Gut etablierte Protokolle Höhere Präzision für höhere Reproduzierbarkeit
von Labor zu Labor

dPCR-Reaktionen bleiben auch in Gegenwart von Inhibitoren wie Huminsäure und Heparin robust. qPCR- (auf Rotor-Gene Q) und dPCR-Reaktionen (auf QIAcuity) wurden in Gegenwart angegebener Mengen an Inhibitoren mit dem entsprechenden QIAcuity PCR-Master-Mix (EvaGreen) und mit identischen Reaktionsvolumen durchgeführt. Die Quantifizierung zeigt Cq (qPCR) oder Kopien/µl (dPCR) als relative Unterschiede zwischen den Proben, wobei die nicht inhibierte Probe auf 100 % gesetzt wird.
dPCR-Reaktionen bleiben auch in Gegenwart von Inhibitoren wie Huminsäure und Heparin robust. qPCR- (auf Rotor-Gene Q) und dPCR-Reaktionen (auf QIAcuity) wurden in Gegenwart angegebener Mengen an Inhibitoren mit dem entsprechenden QIAcuity PCR-Master-Mix (EvaGreen) und mit identischen Reaktionsvolumen durchgeführt. Die Quantifizierung zeigt Cq (qPCR) oder Kopien/µl (dPCR) als relative Unterschiede zwischen den Proben, wobei die nicht inhibierte Probe auf 100 % gesetzt wird.
1 Cq in der qPCR, was für 50 % Präzision steht, ist gleichbedeutend mit 10 % in dPCR und entspricht einer 2-fachen Konzentrationssteigerung.

Wann ist dPCR und wann qPCR einzusetzen?

Wenn es bei der molekularbiologischen und Genomik-Forschung um die Quantifizierung von Nukleinsäuren geht, stehen Wissenschaftler häufig am Scheideweg. Welche Quantifizierungstechnik eignet sich besser, um die eigenen Forschungsziele möglichst effizient zu erreichen – die präzisere und robuste digitale PCR (digital PCR, dPCR) oder die standardisiertere und vertraute quantitative Real-time PCR (quantitative PCR, qPCR)? Beide Technologien haben Gemeinsamkeiten, aber auch jeweils eigene Vorzüge und Einschränkungen, die die Entscheidung anwendungsabhängig machen.

Das Anwendungsraster gibt den Grad der Eignung jeder Technologie für einige der gängigsten Anwendungen an.

Rare mutation detection Copy number variation analysis Gene expression analysis miRNA expression analysis Microbial pathogen detection Viral load quantification Liquid biopsy GMO detection Genome edit detection NGS library quantification and validation Residual host cell quantification qPCR dPCR Applications Suitability level
Finden Sie heraus, was die dPCR für Sie tun kann
Die digitale PCR und insbesondere die Nanoplatten-basierte Technologie von QIAGEN machen es möglich, völlig neue Fragestellungen zu beantworten, wodurch sie für eine breite Palette an Anwendungen geeignet ist.
VORTEILE ENTDECKEN

Forscher beschreiben die Vorteile der dPCR gegenüber qPCR
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Sehen Sie sich einige beispielhafte Studien an, bei denen dPCR eingesetzt wurde, um die Beschränkungen der qPCR zu überwinden.

dPCR-Leitfaden für Anfänger
Diese Ressourcen haben das Ziel, all jenen, die den Wechsel zur dPCR in Betracht ziehen und ihr erstes Experiment planen möchten, wertvolle Ratschläge an die Hand zu geben.
ERSTE SCHRITTE

Umstellung von qPCR auf dPCR
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Das QIAcuity Nanoplate Digital PCR System macht es einfacher und erschwinglicher als je zuvor, die dPCR auch in Ihr Labor zu bringen.

Vorgestellte Webinare

Tipps und Tricks für die digitale PCR
Hier finden Sie eine Zusammenstellung unserer 20 häufigsten Fragen nebst hilfreicher Antworten aus unserem Gäste-Webinar.
Alle Fragen und Antworten lesen

FAQs über die Umstellung von qPCR auf dPCR